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猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一类重要的人兽共患病原菌,其中猪链球菌2型(SS2)、7型(SS7)和9型(SS9)对畜牧业的生产和公共卫生造成的威胁尤甚。兽医临床上,通常使用抗生素治疗猪链球菌的感染,但由于抗生素的不合理使用,导致抗生素严重残留,同时加剧了猪链球菌耐药性的产生。因此,疫苗仍然是目前预防及控制猪链球菌感染最为有效的策略。然而,目前商品化的猪链球菌全菌灭活疫苗尚存在交叉保护力欠佳等问题,迫切需要研制安全、高效的通用型猪链球菌疫苗,因此本文开展了猪链球菌多表位亚单位疫苗的研究。为了筛选和鉴定猪链球菌的B细胞优势表位蛋白,利用TMHMM、SignalP、ABCpred、BepiPred 2.0、Sopma、DNASTAR Protean等生物信息学软件,对猪链球菌3个重要的保护性抗原磷酸-3-甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase released protein,MRP)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLDH)进行了B细胞表位预测,最终获得15个猪链球菌B细胞抗原优势表位。利用GGGG柔性片段将表位串联,构建重组质粒GMD-pET-28a。将重组质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化和内毒素去除处理后,最终得到蛋白大小43.3kDa,浓度3.34mg/mL的多表位串联蛋白GMD。为了探索多表位串联蛋白GMD能否保护机体抵御来自不同血清型的猪链球菌感染,将GMD蛋白分别免疫小鼠和斑马鱼,检测GMD对SS2、SS7和SS9感染后的免疫保护力。在对小鼠进行三次GMD蛋白免疫后,通过间接ELISA法,检测到GMD蛋白能诱发小鼠机体产生针对SS2、SS7和SS9的高水平特异性抗体。在此基础上,应用斑马鱼进行GMD蛋白的免疫实验,经两次免疫后,分别用SS2、SS7和SS9进行攻击,结果显示GMD蛋白能够对SS2、SS7和SS9的感染提供良好的交叉保护能力。为了增强GMD蛋白的免疫保护效力,采用GMD蛋白联合Toll样受体4(TLR4)的激动剂——MPLA(GMD+MPLA),开展小鼠免疫保护试验。研究表明,MPLA能够作为一类疫苗佐剂,刺激仔猪产生强烈的非特异性免疫应答。实验结果显示GMD+MPLA免疫的小鼠体内能够分泌大量的特异性抗体,可完全抵御猪链球菌感染,免疫保护率达100%。免疫后小鼠血清细胞因子检测结果表明MPLA能够同时激发Thl型和Th2型的T细胞免疫应答,不仅可以辅助B细胞产生抗体,同时又能激活细胞免疫应答关键因子。值得一提的是,相较于全菌灭活苗免疫组,GMD+MPLA疫苗对小鼠的应激更小,更加安全。综上所述,本研究首先利用表位分析软件,预测并获取了GAPDH、MRP、DLDH三个蛋白的15个B细胞优势表位。通过斑马鱼免疫保护实验,证明GMD蛋白能够保护机体抵御SS2、SS7和SS9的体内感染。进一步,通过小鼠免疫保护试验,证明了GMD联合MPLA佐剂的使用可以显著提升小鼠的存活率,达到100%的免疫保护效果,且无不良反应。本研究为安全、高效通用型猪链球菌表位亚单位疫苗的研制提供了基础实验数据和新思路。