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矽肺是由于长期吸入工业性粉尘(主要含有二氧化硅，SiO2)沉积于肺组织而引起的全身性疾病，主要病理改变为肺和淋巴结内(煤)矽结节形成和弥漫性肺间质纤维化。肌成纤维细胞是致肺纤维化最重要的效应细胞，具有较强的收缩和分泌细胞外基质的能力。课题组最近研究发现，乙酰化微管蛋白α(acetylatedtubulinα,Ac-α-Tub)在矽肺大鼠矽结节和弥漫性间质纤维化区域中表达缺失。而以Ac-α-Tub为基本组成单位的初级纤毛在器官纤维化中扮演重要的角色，参与肺泡上皮屏障(alveolar epithelial barrier, AEB)损伤、细胞增殖和凋亡、成纤维细胞或上皮细胞向肌成纤维细胞转化等诸多环节。因此初级纤毛可能成为研究矽肺发生、发展机制有意义的切入点。
N-乙酰-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)是具有抗器官纤维化作用的活性四肽。课题组近期报道，Ac-SDKP通过对Ac-α-Tub的调节发挥其抑制矽肺纤维化的作用。本研究通过矽肺病人、矽肺大鼠模型结合体外肌成纤维细胞转化模型，拟探讨如下三个问题：1)初级纤毛在矽肺发生、发展中的变化。2)初级纤毛对肌成纤维细胞转化和细胞增殖的调节作用和机制。3)Ac-SDKP可否通过调节初级纤毛从而发挥抗矽肺纤维化的作用及相关机制探讨。
第一部分初级纤毛在矽肺纤维化发生、发展中的变化和意义
目的：构建矽肺大鼠模型并收集人体矽肺尸检标本和矽肺患者肺泡灌洗液，观察初级纤毛在矽肺发生、发展中的变化和临床病理学意义。
方法：
1.构建大鼠矽肺模型：采用HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建大鼠矽肺模型。大鼠随机分为6组，对照4周、8周和16周组；矽肺4周、8周和16周组(n=10)。矽肺模型组大鼠暴露于SiO2染尘仓，3h/天，持续至4、8和16周处死。对照组大鼠暴露于纯净气(无SiO2)，3h/天，4、8、16周，持续至4、8和16周处死。
2.(煤)矽肺患者尸检样本来自于华北理工大学病理学系，肺泡灌洗液样本来自于中国煤矿工人北戴河疗养院，56例尸检病例，其中(煤)矽尘性反应(0+期)8例、Ⅰ期(煤)矽肺16例、Ⅱ期(煤)矽肺16例、Ⅲ期(煤)矽肺16例。
3.采用H&E染色、天狼星红染色法观察矽肺大鼠肺组织病理形态的改变。
4.采用Ac-α-Tub标记初级纤毛，免疫荧光法观察初级纤毛在肺组织中的定位和表达，并测量初级纤毛长度的变化。
5.收集矽肺大鼠肺组织匀浆和矽肺患者肺泡灌洗液，Westernblot法检测纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagentypeⅠ,COLⅠ)、初级纤毛标记蛋白Ac-α-Tub、驱动蛋白家族蛋白3a(kinesin familymember 3a, Kif3a)和鞭毛内运输蛋白(intraflagellar transport protein, IFT)88的表达。
6.分析纤毛相关蛋白Ac-α-Tub、Kif3a、IFT88与矽肺患者肺功能的相关性。
结果：
1.H&E染色和天狼猩红染色结果显示，对照4周、12周和24周的大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁薄，无明显的炎症反应，且肺组织内红色的胶原纤丝较少；矽肺4周组，大鼠肺组织肺泡壁增宽，巨噬细胞浸润肺泡腔，同时肺组织内可见孤立的矽结节；大鼠染尘至12周，肺组织结构更加紊乱，同时可见矽结节融合的现象；至染尘24周，肺组织内出现大的融合性矽结节。矽肺4周、12周和24周大鼠的肺组织内，可见胶原纤维大量沉积于矽结节和弥漫性间质纤维化区域。此外，WesternBlot检测α-SMA和COLⅠ蛋白在矽肺4周、12周和24周大鼠的肺组织中表达均明显高于对照4周、12周和24周组。
2.免疫荧光结果显示，在对照24周组肺泡壁多种细胞中可见到初级纤毛伸入肺泡腔；在矽肺24周肺组织中，初级纤毛仅在较为正常的肺组织可被检测，而在矽结节中缺失。WesternBlot进一步检测初级纤毛相关蛋白，Ac-α-Tub、Kif3a和IFT88在矽肺4周组与对照4周组相比表达明显上调，然而矽肺12周、24周组Ac-α-Tub、Kif3a和IFT88蛋白的表达与相应时间点对照组相比表达水平明显下调。
3.在矽肺人体标本中，初级纤毛在癌旁和矽结节周边的肺泡壁细胞中可被检测到，然而在细胞性和纤维性矽结节中初级纤毛表达缺失。Ac-α-Tub在Ⅱ期矽肺患者的肺泡灌洗液中表达最高，Kif3a在Ⅲ期矽肺患者的肺泡灌洗液中表达最高，且肺泡灌洗液中Kif3a的含量与矽肺患者肺功能负相关。
第二部分Kif3a调节初级纤毛影响肌成纤维细胞转化和增殖的机制
目的：探讨初级纤毛的长度变化对肌成纤维细胞转化和细胞增殖的作用机制。
方法：
1.构建SiO2诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化模型：SiO2(50μg/m2)诱导MRC-5人胚肺成纤维细胞0h、0.5h、1h、3h、12h、24h、48h、72h，收集成纤维细胞裂解液，Westernblot法检测α-SMA、Ⅰ型胶原、Ac-α-Tub、Kif3a和IFT88的表达。
2.WesternBlot和免疫荧光筛选有效的KIF3A-siRNA，SiO2刺激或无血清培养12小时后分别转染NC-siRNA和KIF3A-siRNA持续至36小时提取蛋白。
3.WesternBlot检测α-SMA、COLⅠ、血清反应因子(serum response factor, SRF)、心肌相关转录因子-A(Myocardin-related transcription factor-A, MRTF-A)蛋白以及刺猬信号(Hedgehog)下游转录因子GLI家族锌指蛋白GLI1、GLI2和GLI3和靶蛋白cyclinD1的表达。
4.免疫共沉淀检测Kif3a与转录因子的相互结合。
5.生物信息学预测转录抑制因子GLI3与靶基因ACTA2(α-SMA的基因)的结合位点，染色质免疫共沉淀验证GLI3与靶基因结合。
6.构建KIF3A过表达的细胞系，WesternBlot验证，免疫荧光检测初级纤毛的变化，并给予SiO2刺激，WesternBlot检测转录因子GLI2、GLI3和靶蛋白α-SMA和cyclinD1的表达。
结果：
1.SiO2诱导可逐渐上调MRC-5肺成纤维细胞α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平，提示发生肌成纤维细胞转化。初级纤毛在诱导过程中呈现先延长、后缩短的变化特点，在SiO2刺激12小时最长；且Ac-α-Tub、Kif3a和IFT88蛋白表达在SiO2刺激12小时达到最高水平，随后逐渐下降。
2.KIF3A-siRNA＃2可明显降低Kif3a蛋白的表达水平，与NC-siRNA组相比，KIF3A-siRNA＃2转染后Kif3a蛋白表达水平最低，同时该组的Ac-α-Tub蛋白的表达水平也较NC-siRNA＃2组明显下调，初级纤毛的长度明显缩短。
3.WesternBlot检测结果显示，无血清培养的成纤维细胞给予KIF3A-siRNA＃2沉默初级纤毛后COLⅠ、α-SMA、MRTF-A和SRF蛋白的表达水平与沉默对照组相比无明显差异，而SiO2刺激后给予KIF3A-siRNA＃2沉默，与沉默对照组相比，COLⅠ、α-SMA、MRTF-A和SRF蛋白的表达水平显著上调。
4.无血清培养条件下给予KIF3A-siRNA＃2沉默初级纤毛，GLI2FL、GLI2R、GLI3R表达水平与转染对照组相比显著下调，GLI1、GLI3FL和cyclinD1表达水平无差异；而SiO2刺激后给予KIF3A-siRNA＃2沉默，与沉默对照组相比，GLI1和GLI3R表达水平显著下调，GLI3FL和cyclinD1表达水平显著上调，而GLI2FL和GLI2R的表达水平无差异。
5.免疫共沉淀结果显示，Kif3a可与GLI2FL、GLI3FL和GLI3R结合。在SiO2刺激12h时，Kif3a与GLI2FL、GLI3FL和GLI3R结合均高于对照组，而SiO2刺激48h时，Kif3a与GLI3R的结合水平依然较高，而与GLI3FL和GLI2FL的结合水平明显降低。
6.在转染对照组的细胞中，Kif3a和GLI3FL主要定位于细胞质，而GLI3R在细胞核中的比例较高，给予SiO2刺激后，细胞核内Kif3a和GLI3FL比例显著提高，而沉默KIF3A后，与转染对照组相比，Kif3a和GLI3R在各亚细胞成分中的表达量均明显下调，且各亚细胞成分中GLI3R/GLI3FL的比值明显降低。
7.通过生物学预测发现，GLI3可直接与α-SMA的基因ACTA2结合，抑制其转录。进一步通过染色质免疫共沉淀实验证实了GLI3与ACTA2的结合。
8.免疫荧光结果显示KIF3A-cpDNA可有效的延长初级纤毛的长度，WesternBlot结果显示，与对照组相比，SiO2刺激组GLI2FL和α-SMA蛋白表达水平明显上调，GLI3R蛋白表达水平明显下调；而KIF3A过表达后与SiO2刺激组相比，cyclinD1和α-SMA蛋白表达水平明显下调，GLI3R蛋白表达水平明显上调，而GLI2FL蛋白的表达无差异。
第三部分Ac-SDKP活化α-TAT1调节初级纤毛促进肌成纤维细胞凋亡
目的：矽肺大鼠给予Ac-SDKP抗纤维化治疗，双刺激诱导MRC-5成纤维细胞向肌成纤维细胞转化模型给予Ac-SDKP后处理，并转染纤毛调节蛋白ATAT1-siRNA沉默初级纤毛，观察初级纤毛在Ac-SDKP抗矽肺纤维化中的作用。
方法：
1.大鼠矽肺模型采用HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建。大鼠随机分为3组：对照24周组、矽肺24周组和Ac-SDKP抗纤维化治疗组(n=10)。
2.天狼猩红染色检测大鼠组织胶原沉积；免疫荧光法检测α-SMA与caspase3在肺组织内的定位和共表达；免疫组化染色检测α-TAT1、Ac-α-Tub、caspase3在肺组织内的定位和表达；WesternBlot检测α-SMA、COLⅠ、α-TAT1、Ac-α-Tub、Kif3a、γH2AX、p21、cyclinD1和caspase3的表达。
3.研究矽肺伴随的成纤维细胞增殖和凋亡，MRC-5细胞分组如下：对照组、TGF-β1刺激组、SiO2刺激组、TGF-β1+SiO2双刺激组。WesternBlot检测α-SMA、COLⅠ、Ac-α-Tub和凋亡相关蛋白caspase3的表达。
4.CCK8检测细胞的活性；免疫荧光法检测α-SMA和Ac-α-Tub的共定位和表达；流式细胞术检测细胞周期；WesternBlot检测α-SMA、COLⅠ、α-TAT1、Ac-α-Tub、Kif3a、γH2AX、p21、cyclinD1和caspase3的表达。
5.MRC-5成纤维细胞分为：对照组(无血清培养基)、Ac-SDKP(10-8mol/L )组、TGF-β1+SiO2组、TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP组。筛选ATAT1-siRNA序列，TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP处理的细胞给予ATAT1-siRNA干扰。构建ATAT1过表达的细胞系，免疫荧光检测初级纤毛长度的变化。TGF-β1+SiO2双刺激后给予ATAT1过表达，免疫荧光检测α-TAT1与α-SMA和α-TAT1与γH2AX的共表达；WesternBlot检测α-SMA、cyclinD1、p21和caspase3蛋白的表达。
结果：
1.天狼猩红染色结果显示，矽肺24周组大鼠肺组织纤维化严重，胶原沉积明显，α-SMA、COLⅠ蛋白表达与对照24周组大鼠相比明显上调，Ac-SDKP可明显的减小矽结节的面积和肺组织内胶原含量，下调α-SMA和COLⅠ蛋白的表达水平。
2.对照组大鼠肺组织内α-SMA和caspase3的荧光强度均较低，矽肺24周组大鼠肺组织内α-SMA在矽结节中明显阳性表达，而caspase3阳性表达的细胞主要定位于矽结节周边。Ac-SDKP组大鼠肺组织内矽结节明显减小，α-SMA和caspase3在矽结节内共表达。
3.免疫组化结果显示，在正常大鼠的肺泡壁细胞中，α-TAT1和Ac-α-Tub阳性显色明显，caspase3几乎无阳性显色；α-TAT1、Ac-α-Tub和caspase3在矽肺24周组大鼠矽结节中几乎无表达，而在结节周边有阳性显色；给予Ac-SDKP治疗后，大鼠矽结节内α-TAT1和caspase3在矽结节中阳性显色明显，而Ac-α-Tub依然仅阳性表达与矽结节周边较正常的肺组织。
4.Westernblot结果显示，与对照24周组相比，矽肺24周组大鼠肺组织内γH2AX、p21和caspase3表达明显上调，而α-TAT1、Ac-α-Tub和Kif3a表达明显下调。Ac-SDKP治疗后与模型组相比可显著的下调γH2AX、p21和caspase3表达并上调α-TAT1、Ac-α-Tub和Kif3a的表达。
5.免疫荧光和WesternBlot结果显示，TGF-β1、SiO2或TGF-β1+SiO2双刺激均可上调COLⅠ、α-SMA蛋白和下调Ac-α-Tub蛋白表达水平，且双刺激组COLⅠ、α-SMA蛋白表达水平最高，Ac-α-Tub蛋白表达水平最低。此外TGF-β1可下调c-Caspase3蛋白的表达水平，与之相反，SiO2可上调c-Caspase3蛋白的表达水平。
6.CCK8结果显示，TGF-β1+SiO2双刺激24h内，MRC-5细胞的活性几乎无变化，24h后给予Ac-SDKP治疗，可明显抑制细胞的活性。
7.免疫荧光结果显示，无血清处理的细胞，给予Ac-SDKP处理可明显的延长初级纤毛的长度，α-SMA在无血清对照组和Ac-SDKP单独处理组中均几乎无表达；双刺激组初级几乎消失，α-SMA阳性表达明显，双刺激24h后给予Ac-SDKP处理可明显抑制α-SMA荧光表达，并促进Ac-α-Tub阳性表达于细胞质微管蛋白和初级纤毛。
8.Westernblot结果显示，Ac-SDKP单独处理组与无血清对照组相比，COLⅠ、α-SMA、c-Caspase3、γH2AX、α-TAT1和Ac-α-Tub表达无差异，p21表达明显上调；TGF-β1+SiO2组无血清对照组相比，COLⅠ和α-SMA表达显著上调，c-Caspase3、α-TAT1和Ac-α-Tub显著下调，而γH2AX和p21无差异；TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP组与TGF-β1+SiO2组相比，可显著下调COLⅠ和α-SMA的表达，同时上调c-Caspase3、γH2AX、p21、α-TAT1和Ac-α-Tub的表达。而ATAT1siR＃1转染可显著的阻断TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP介导的c-Caspase3、γH2AX、p21、α-TAT1、Ac-α-Tub表达上调和COLⅠ、α-SMA的表达下调。
9.流式细胞术结果所示，Ac-SDKP单独处理组MRC-5细胞S期的比例减少，G0/G1期细胞比例增加，TGF-β1+SiO2刺激可明显的增加S期的细胞比例，减少G0/G1期细胞比例，TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP组与TGF-β1+SiO2组相比，可进一步减少S期细胞比例和增加G0/G1期细胞比例。
10.免疫荧光和WesternBlot结果显示，ATAT1-cpDNA可上调α-TAT1和Ac-α-Tub的表达水平，高表达的Ac-α-Tub定位于微管骨架蛋白和初级纤毛，且微管骨架密集的细胞核中可见基因损伤标记物γH2AX蛋白的表达。
11.ATAT1-cpDNA组与阴性对照组相比，细胞收缩明显，α-SMA骨架发生断裂，cyclinD1和α-SMA表达水平降低，而p21和c-Caspase3的表达水平明显升高。
结论：
1.矽肺纤维化伴随初级纤毛缺失，导致纤毛调节蛋白Kif3a表达水平降低而无法维持转录抑制因子GLI3R的稳定，从而解除了对靶基因cyclinD1和α-SMA基因的转录抑制作用，促进细胞增殖和肌成纤维细胞转化。
2.Ac-SDKP抗纤维化治疗可上调Kif3a和α-TAT1蛋白稳定乙酰化微管蛋白骨架并延长初级纤毛，导致已发生肌成纤维细胞转化的细胞基因损伤、细胞周期停滞和凋亡，从而减轻矽肺纤维化水平。
N-乙酰-丝氨酰-天门冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)是具有抗器官纤维化作用的活性四肽。课题组近期报道，Ac-SDKP通过对Ac-α-Tub的调节发挥其抑制矽肺纤维化的作用。本研究通过矽肺病人、矽肺大鼠模型结合体外肌成纤维细胞转化模型，拟探讨如下三个问题：1)初级纤毛在矽肺发生、发展中的变化。2)初级纤毛对肌成纤维细胞转化和细胞增殖的调节作用和机制。3)Ac-SDKP可否通过调节初级纤毛从而发挥抗矽肺纤维化的作用及相关机制探讨。
第一部分初级纤毛在矽肺纤维化发生、发展中的变化和意义
目的：构建矽肺大鼠模型并收集人体矽肺尸检标本和矽肺患者肺泡灌洗液，观察初级纤毛在矽肺发生、发展中的变化和临床病理学意义。
方法：
1.构建大鼠矽肺模型：采用HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建大鼠矽肺模型。大鼠随机分为6组，对照4周、8周和16周组；矽肺4周、8周和16周组(n=10)。矽肺模型组大鼠暴露于SiO2染尘仓，3h/天，持续至4、8和16周处死。对照组大鼠暴露于纯净气(无SiO2)，3h/天，4、8、16周，持续至4、8和16周处死。
2.(煤)矽肺患者尸检样本来自于华北理工大学病理学系，肺泡灌洗液样本来自于中国煤矿工人北戴河疗养院，56例尸检病例，其中(煤)矽尘性反应(0+期)8例、Ⅰ期(煤)矽肺16例、Ⅱ期(煤)矽肺16例、Ⅲ期(煤)矽肺16例。
3.采用H&E染色、天狼星红染色法观察矽肺大鼠肺组织病理形态的改变。
4.采用Ac-α-Tub标记初级纤毛，免疫荧光法观察初级纤毛在肺组织中的定位和表达，并测量初级纤毛长度的变化。
5.收集矽肺大鼠肺组织匀浆和矽肺患者肺泡灌洗液，Westernblot法检测纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagentypeⅠ,COLⅠ)、初级纤毛标记蛋白Ac-α-Tub、驱动蛋白家族蛋白3a(kinesin familymember 3a, Kif3a)和鞭毛内运输蛋白(intraflagellar transport protein, IFT)88的表达。
6.分析纤毛相关蛋白Ac-α-Tub、Kif3a、IFT88与矽肺患者肺功能的相关性。
结果：
1.H&E染色和天狼猩红染色结果显示，对照4周、12周和24周的大鼠肺组织结构清晰，肺泡壁薄，无明显的炎症反应，且肺组织内红色的胶原纤丝较少；矽肺4周组，大鼠肺组织肺泡壁增宽，巨噬细胞浸润肺泡腔，同时肺组织内可见孤立的矽结节；大鼠染尘至12周，肺组织结构更加紊乱，同时可见矽结节融合的现象；至染尘24周，肺组织内出现大的融合性矽结节。矽肺4周、12周和24周大鼠的肺组织内，可见胶原纤维大量沉积于矽结节和弥漫性间质纤维化区域。此外，WesternBlot检测α-SMA和COLⅠ蛋白在矽肺4周、12周和24周大鼠的肺组织中表达均明显高于对照4周、12周和24周组。
2.免疫荧光结果显示，在对照24周组肺泡壁多种细胞中可见到初级纤毛伸入肺泡腔；在矽肺24周肺组织中，初级纤毛仅在较为正常的肺组织可被检测，而在矽结节中缺失。WesternBlot进一步检测初级纤毛相关蛋白，Ac-α-Tub、Kif3a和IFT88在矽肺4周组与对照4周组相比表达明显上调，然而矽肺12周、24周组Ac-α-Tub、Kif3a和IFT88蛋白的表达与相应时间点对照组相比表达水平明显下调。
3.在矽肺人体标本中，初级纤毛在癌旁和矽结节周边的肺泡壁细胞中可被检测到，然而在细胞性和纤维性矽结节中初级纤毛表达缺失。Ac-α-Tub在Ⅱ期矽肺患者的肺泡灌洗液中表达最高，Kif3a在Ⅲ期矽肺患者的肺泡灌洗液中表达最高，且肺泡灌洗液中Kif3a的含量与矽肺患者肺功能负相关。
第二部分Kif3a调节初级纤毛影响肌成纤维细胞转化和增殖的机制
目的：探讨初级纤毛的长度变化对肌成纤维细胞转化和细胞增殖的作用机制。
方法：
1.构建SiO2诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化模型：SiO2(50μg/m2)诱导MRC-5人胚肺成纤维细胞0h、0.5h、1h、3h、12h、24h、48h、72h，收集成纤维细胞裂解液，Westernblot法检测α-SMA、Ⅰ型胶原、Ac-α-Tub、Kif3a和IFT88的表达。
2.WesternBlot和免疫荧光筛选有效的KIF3A-siRNA，SiO2刺激或无血清培养12小时后分别转染NC-siRNA和KIF3A-siRNA持续至36小时提取蛋白。
3.WesternBlot检测α-SMA、COLⅠ、血清反应因子(serum response factor, SRF)、心肌相关转录因子-A(Myocardin-related transcription factor-A, MRTF-A)蛋白以及刺猬信号(Hedgehog)下游转录因子GLI家族锌指蛋白GLI1、GLI2和GLI3和靶蛋白cyclinD1的表达。
4.免疫共沉淀检测Kif3a与转录因子的相互结合。
5.生物信息学预测转录抑制因子GLI3与靶基因ACTA2(α-SMA的基因)的结合位点，染色质免疫共沉淀验证GLI3与靶基因结合。
6.构建KIF3A过表达的细胞系，WesternBlot验证，免疫荧光检测初级纤毛的变化，并给予SiO2刺激，WesternBlot检测转录因子GLI2、GLI3和靶蛋白α-SMA和cyclinD1的表达。
结果：
1.SiO2诱导可逐渐上调MRC-5肺成纤维细胞α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平，提示发生肌成纤维细胞转化。初级纤毛在诱导过程中呈现先延长、后缩短的变化特点，在SiO2刺激12小时最长；且Ac-α-Tub、Kif3a和IFT88蛋白表达在SiO2刺激12小时达到最高水平，随后逐渐下降。
2.KIF3A-siRNA＃2可明显降低Kif3a蛋白的表达水平，与NC-siRNA组相比，KIF3A-siRNA＃2转染后Kif3a蛋白表达水平最低，同时该组的Ac-α-Tub蛋白的表达水平也较NC-siRNA＃2组明显下调，初级纤毛的长度明显缩短。
3.WesternBlot检测结果显示，无血清培养的成纤维细胞给予KIF3A-siRNA＃2沉默初级纤毛后COLⅠ、α-SMA、MRTF-A和SRF蛋白的表达水平与沉默对照组相比无明显差异，而SiO2刺激后给予KIF3A-siRNA＃2沉默，与沉默对照组相比，COLⅠ、α-SMA、MRTF-A和SRF蛋白的表达水平显著上调。
4.无血清培养条件下给予KIF3A-siRNA＃2沉默初级纤毛，GLI2FL、GLI2R、GLI3R表达水平与转染对照组相比显著下调，GLI1、GLI3FL和cyclinD1表达水平无差异；而SiO2刺激后给予KIF3A-siRNA＃2沉默，与沉默对照组相比，GLI1和GLI3R表达水平显著下调，GLI3FL和cyclinD1表达水平显著上调，而GLI2FL和GLI2R的表达水平无差异。
5.免疫共沉淀结果显示，Kif3a可与GLI2FL、GLI3FL和GLI3R结合。在SiO2刺激12h时，Kif3a与GLI2FL、GLI3FL和GLI3R结合均高于对照组，而SiO2刺激48h时，Kif3a与GLI3R的结合水平依然较高，而与GLI3FL和GLI2FL的结合水平明显降低。
6.在转染对照组的细胞中，Kif3a和GLI3FL主要定位于细胞质，而GLI3R在细胞核中的比例较高，给予SiO2刺激后，细胞核内Kif3a和GLI3FL比例显著提高，而沉默KIF3A后，与转染对照组相比，Kif3a和GLI3R在各亚细胞成分中的表达量均明显下调，且各亚细胞成分中GLI3R/GLI3FL的比值明显降低。
7.通过生物学预测发现，GLI3可直接与α-SMA的基因ACTA2结合，抑制其转录。进一步通过染色质免疫共沉淀实验证实了GLI3与ACTA2的结合。
8.免疫荧光结果显示KIF3A-cpDNA可有效的延长初级纤毛的长度，WesternBlot结果显示，与对照组相比，SiO2刺激组GLI2FL和α-SMA蛋白表达水平明显上调，GLI3R蛋白表达水平明显下调；而KIF3A过表达后与SiO2刺激组相比，cyclinD1和α-SMA蛋白表达水平明显下调，GLI3R蛋白表达水平明显上调，而GLI2FL蛋白的表达无差异。
第三部分Ac-SDKP活化α-TAT1调节初级纤毛促进肌成纤维细胞凋亡
目的：矽肺大鼠给予Ac-SDKP抗纤维化治疗，双刺激诱导MRC-5成纤维细胞向肌成纤维细胞转化模型给予Ac-SDKP后处理，并转染纤毛调节蛋白ATAT1-siRNA沉默初级纤毛，观察初级纤毛在Ac-SDKP抗矽肺纤维化中的作用。
方法：
1.大鼠矽肺模型采用HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建。大鼠随机分为3组：对照24周组、矽肺24周组和Ac-SDKP抗纤维化治疗组(n=10)。
2.天狼猩红染色检测大鼠组织胶原沉积；免疫荧光法检测α-SMA与caspase3在肺组织内的定位和共表达；免疫组化染色检测α-TAT1、Ac-α-Tub、caspase3在肺组织内的定位和表达；WesternBlot检测α-SMA、COLⅠ、α-TAT1、Ac-α-Tub、Kif3a、γH2AX、p21、cyclinD1和caspase3的表达。
3.研究矽肺伴随的成纤维细胞增殖和凋亡，MRC-5细胞分组如下：对照组、TGF-β1刺激组、SiO2刺激组、TGF-β1+SiO2双刺激组。WesternBlot检测α-SMA、COLⅠ、Ac-α-Tub和凋亡相关蛋白caspase3的表达。
4.CCK8检测细胞的活性；免疫荧光法检测α-SMA和Ac-α-Tub的共定位和表达；流式细胞术检测细胞周期；WesternBlot检测α-SMA、COLⅠ、α-TAT1、Ac-α-Tub、Kif3a、γH2AX、p21、cyclinD1和caspase3的表达。
5.MRC-5成纤维细胞分为：对照组(无血清培养基)、Ac-SDKP(10-8mol/L )组、TGF-β1+SiO2组、TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP组。筛选ATAT1-siRNA序列，TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP处理的细胞给予ATAT1-siRNA干扰。构建ATAT1过表达的细胞系，免疫荧光检测初级纤毛长度的变化。TGF-β1+SiO2双刺激后给予ATAT1过表达，免疫荧光检测α-TAT1与α-SMA和α-TAT1与γH2AX的共表达；WesternBlot检测α-SMA、cyclinD1、p21和caspase3蛋白的表达。
结果：
1.天狼猩红染色结果显示，矽肺24周组大鼠肺组织纤维化严重，胶原沉积明显，α-SMA、COLⅠ蛋白表达与对照24周组大鼠相比明显上调，Ac-SDKP可明显的减小矽结节的面积和肺组织内胶原含量，下调α-SMA和COLⅠ蛋白的表达水平。
2.对照组大鼠肺组织内α-SMA和caspase3的荧光强度均较低，矽肺24周组大鼠肺组织内α-SMA在矽结节中明显阳性表达，而caspase3阳性表达的细胞主要定位于矽结节周边。Ac-SDKP组大鼠肺组织内矽结节明显减小，α-SMA和caspase3在矽结节内共表达。
3.免疫组化结果显示，在正常大鼠的肺泡壁细胞中，α-TAT1和Ac-α-Tub阳性显色明显，caspase3几乎无阳性显色；α-TAT1、Ac-α-Tub和caspase3在矽肺24周组大鼠矽结节中几乎无表达，而在结节周边有阳性显色；给予Ac-SDKP治疗后，大鼠矽结节内α-TAT1和caspase3在矽结节中阳性显色明显，而Ac-α-Tub依然仅阳性表达与矽结节周边较正常的肺组织。
4.Westernblot结果显示，与对照24周组相比，矽肺24周组大鼠肺组织内γH2AX、p21和caspase3表达明显上调，而α-TAT1、Ac-α-Tub和Kif3a表达明显下调。Ac-SDKP治疗后与模型组相比可显著的下调γH2AX、p21和caspase3表达并上调α-TAT1、Ac-α-Tub和Kif3a的表达。
5.免疫荧光和WesternBlot结果显示，TGF-β1、SiO2或TGF-β1+SiO2双刺激均可上调COLⅠ、α-SMA蛋白和下调Ac-α-Tub蛋白表达水平，且双刺激组COLⅠ、α-SMA蛋白表达水平最高，Ac-α-Tub蛋白表达水平最低。此外TGF-β1可下调c-Caspase3蛋白的表达水平，与之相反，SiO2可上调c-Caspase3蛋白的表达水平。
6.CCK8结果显示，TGF-β1+SiO2双刺激24h内，MRC-5细胞的活性几乎无变化，24h后给予Ac-SDKP治疗，可明显抑制细胞的活性。
7.免疫荧光结果显示，无血清处理的细胞，给予Ac-SDKP处理可明显的延长初级纤毛的长度，α-SMA在无血清对照组和Ac-SDKP单独处理组中均几乎无表达；双刺激组初级几乎消失，α-SMA阳性表达明显，双刺激24h后给予Ac-SDKP处理可明显抑制α-SMA荧光表达，并促进Ac-α-Tub阳性表达于细胞质微管蛋白和初级纤毛。
8.Westernblot结果显示，Ac-SDKP单独处理组与无血清对照组相比，COLⅠ、α-SMA、c-Caspase3、γH2AX、α-TAT1和Ac-α-Tub表达无差异，p21表达明显上调；TGF-β1+SiO2组无血清对照组相比，COLⅠ和α-SMA表达显著上调，c-Caspase3、α-TAT1和Ac-α-Tub显著下调，而γH2AX和p21无差异；TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP组与TGF-β1+SiO2组相比，可显著下调COLⅠ和α-SMA的表达，同时上调c-Caspase3、γH2AX、p21、α-TAT1和Ac-α-Tub的表达。而ATAT1siR＃1转染可显著的阻断TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP介导的c-Caspase3、γH2AX、p21、α-TAT1、Ac-α-Tub表达上调和COLⅠ、α-SMA的表达下调。
9.流式细胞术结果所示，Ac-SDKP单独处理组MRC-5细胞S期的比例减少，G0/G1期细胞比例增加，TGF-β1+SiO2刺激可明显的增加S期的细胞比例，减少G0/G1期细胞比例，TGF-β1+SiO2+Ac-SDKP组与TGF-β1+SiO2组相比，可进一步减少S期细胞比例和增加G0/G1期细胞比例。
10.免疫荧光和WesternBlot结果显示，ATAT1-cpDNA可上调α-TAT1和Ac-α-Tub的表达水平，高表达的Ac-α-Tub定位于微管骨架蛋白和初级纤毛，且微管骨架密集的细胞核中可见基因损伤标记物γH2AX蛋白的表达。
11.ATAT1-cpDNA组与阴性对照组相比，细胞收缩明显，α-SMA骨架发生断裂，cyclinD1和α-SMA表达水平降低，而p21和c-Caspase3的表达水平明显升高。
结论：
1.矽肺纤维化伴随初级纤毛缺失，导致纤毛调节蛋白Kif3a表达水平降低而无法维持转录抑制因子GLI3R的稳定，从而解除了对靶基因cyclinD1和α-SMA基因的转录抑制作用，促进细胞增殖和肌成纤维细胞转化。
2.Ac-SDKP抗纤维化治疗可上调Kif3a和α-TAT1蛋白稳定乙酰化微管蛋白骨架并延长初级纤毛，导致已发生肌成纤维细胞转化的细胞基因损伤、细胞周期停滞和凋亡，从而减轻矽肺纤维化水平。