矽肺是由于在职业活动中长期吸入二氧化硅(Si O2)粉尘引起,其基本病理特征包括矽结节的形成和肺组织纤维化。现有研究显示,肺组织局部肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAS)参与了肺纤维化的发生与发展。作为RAS的关键酶,血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)含有N端和C端两个催化结构域。其中C端结构域能够催化血管紧张素I(angiotensin I,Ang I)转化为血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)。而Ang II是RAS致纤维化效应重要的活性蛋白,其作用主要由血管紧张素II的1型受体(angiotensin II type 1 receptor,AT1R)介导,包括诱导炎症反应,促进成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积。ACE N端结构域可特异性水解抗纤维化短肽N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP),在ACE N端催化结构域缺陷的小鼠体内Ac-SDKP含量明显上调,发挥抗器官纤维化效应。同样,给予外源性Ac-SDKP,亦能够降低ACE野生型鼠肺损伤和肺纤维化程度。可见Ac-SDKP与RAS的交互作用,可能是其抗纤维化作用的重要分子机制之一。在本研究中,以Ang II信号在矽肺纤维化中的作用作为研究的切入点,观察Ac-SDKP能否通过抑制Ang II的作用调控矽肺纤维化的发生与发展。课题组前期研究发现,β2肾上腺素受体-激动型G蛋白(β2 adrenergic receptor-stimulatory G protein,ADRB2-Gs)复合物在矽肺模型中低表达,而在Ac-SDKP抗纤维化治疗组中表达显著上调,提示该蛋白是Ac-SDKP抗矽肺纤维化中的调控蛋白之一。ADRB2抗器官纤维化作用与其促进环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的合成有关。相关研究报道,c AMP信号和Ang II/转化生长因子(transforming gorwth factor-β1,TGF-β1)信号的交互作用在纤维化的发生中发挥了重要作用。c AMP信号能够抑制Ang II/TGF-β1诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化及胶原合成。Ang II/TGF-β1则能够通过上调磷酸二脂酶(phosphodiesterase,PDE)加速c AMP的水解。而Ac-SDKP对c AMP信号和Ang II信号的调控及Ac-SDKP能否通过c AMP信号调节Ang II信号,目前文献报道较少。综合以上研究,本实验通过构建矽肺动物模型结合Ang II诱导的肌成纤维细胞转化模型,观察Ac-SDKP与Ang II信号和c AMP信号的交互作用对矽肺纤维化发生、发展的影响,并分析Ac-SDKP能否通过活化c AMP,促进c AMP依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号及其下游的c AMP应答元件结合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB),从而发挥抗矽肺纤维化的作用。以进一步揭示矽肺发生、发展及Ac-SDKP保护效应的可能机制。第一部分Ac-SDKP、Ang II信号和c AMP信号的动态变化对矽肺纤维化发生、发展的影响目的:通过建立矽肺动物模型,并体外观察Ang II诱导大鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的效应,分析Ac-SDKP、ACE/Ang II/AT1R轴和c AMP信号的变化对矽肺纤维化发生、发展的影响。方法:1采用HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建大鼠矽肺模型。染尘参数:染毒室容积0.3m3,柜内温度20~25℃,湿度70%~75%,压力-50Pa~+50Pa,氧气浓度20%,Si O2粉尘进入速度为3.0~3.5ml/min,柜内粉尘质量浓度2000 mg/m3,每只动物每天染尘3h。3周龄雄性Wistar大鼠随机分为6组,每组10只。分别染尘0周、2周、4周、8周、12周、16周,观察大鼠矽肺形成的动态变化。2观察Ang II(10-7mol/L)诱导不同时间点(0、5min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h)大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的效应。3采用HE染色、Masson染色法观察肺组织病理形态的改变,分别采用免疫组织化学法、Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原、纤连蛋白(fibronectin,Fn)、波形蛋白(Vimentin)、Gαs、抑制型G蛋白(inhibitory G protein,Gαi2/3)、ACE及AT1R的蛋白表达及定位。采用酶免疫分析法(EIA)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测Ac-SDKP、Ang II和c AMP的含量。结果:1 HE染色结果显示,对照组肺组织结构清晰、肺泡壁薄,无明显炎细胞浸润。染尘2周后,可见肺泡壁增宽并伴有巨噬细胞浸润。矽肺模型4周组偶见孤立的细胞性结节形成(主要由巨噬细胞构成)。矽肺模型8周、12周组大鼠肺组织肺泡间隔增宽明显,且细胞性结节数量增多。矽肺模型16周组肺组织内可见多个细胞性结节的融合和间质纤维化的形成,并可见细胞纤维性矽结节的形成。Masson染色显示结节及间质纤维化区域出现蓝紫色胶原沉积,并随模型制备时间的延长逐渐增加,至矽肺模型16周组最为显著。2免疫组织化学染色显示,在矽肺模型16周组,α-SMA标记的肌成纤维细胞主要位于细胞性结节周边及间质纤维化病变区域。Vimentin阳性表达于细胞性结节区域。Western blot结果显示,α-SMA、I型胶原、Fn、Vimentin的蛋白表达在矽肺模型4周、8周、12周、16周较对照组逐渐增多。3 Western blot及ELISA结果显示,与对照组相比在矽肺模型2周、4周、8周、12周、16周组,ACE、Ang II、AT1R的含量逐渐升高。肺组织Ac-SDKP的水平在矽肺模型2周组较对照组明显升高,随后在矽肺模型组4周、8周、12周、16周组含量逐渐降低。4 Western blot结果显示,Gαi2/3的蛋白表达在矽肺模型4周、8周、12周、16周组与对照组比较逐渐增多。在矽肺模型8周组Gαs的蛋白表达及c AMP的含量较对照组开始出现明显降低,至染尘16周达最低。5 Ang II能够诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。α-SMA、I型胶原、Fn的蛋白表达随诱导时间的延长逐渐升高。Gαs、c AMP的表达随Ang II刺激时间的延长逐渐降低,而Gαi2/3的蛋白表达逐渐升高。第二部分Ac-SDKP活化c AMP/PKA信号抑制矽肺纤维化的作用及机制目的:分别给予矽肺大鼠Ac-SDKP和cAMP类似物db-cAMP抗纤维化治疗及预防治疗。体外采用Ang II诱导大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,并给予Ac-SDKP、db-c AMP及选择性PKA阻断剂H89的预处理,观察c AMP/PKA信号活化在Ac-SDKP抑制矽肺纤维化中的作用。方法:1采用HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建大鼠矽肺动物模型,将动物随机分组:1)对照16周组;2)矽肺模型16周组;3)Ac-SDKP抗纤维化治疗组;4)Ac-SDKP预防治疗组;5)db-c AMP抗纤维化治疗组;6)db-c AMP预防治疗组。2原代培养大鼠肺成纤维细胞,实验分组为:1)正常对照组;2)Ang II(10-7mol/L)诱导组;3)Ang II+Ac-SDKP(10-8mol/L)组;4)Ang II+Ac-SDKP+H89(10-6mol/L)组;5)Ang II+db-c AMP(10-4mol/L)组;6)Ang II+db-c AMP+H89组。3采用Western blot、ELSIA法检测体内外α-SMA、I型胶原、Vimentin、Fn、ACE、Ang II、AT1R、Gαs、Gαi2/3、c AMP和PKA的蛋白表达。采用免疫荧光化学染色检测矽肺组织α-SMA/Gαi3及成纤维细胞α-SMA/PKA的共表达。结果:1 Western blot结果显示,与矽肺模型16周组比较,Ac-SDKP及db-c AMP抗纤维化治疗组和预防治疗组α-SMA、I型胶原、Fn和Vimentin的蛋白表达明显下调。2 Western blot结果显示,Ac-SDKP、db-c AMP抗纤维化治疗组和预防治疗组,AT1R的蛋白表达较矽肺模型16周组明显降低,ACE和Ang II的表达在Ac-SDKP和db-c AMP治疗组下降,但差异无统计学意义。3免疫荧光化学染色显示,在矽肺模型16周组,纤维化病变区域有大量绿色荧光标记的α-SMA阳性表达。Gαi3红色荧光的表达亦显著增加,采用两种蛋白荧光组合定位技术,可见α-SMA和Gαi3共表达于矽结节及间质纤维化区域。Ac-SDKP、db-c AMP抗纤维化治疗组和预防治疗组,Gαi3与α-SMA的阳性表达降低。Western blot结果显示,与矽肺模型16周组相比,在Ac-SDKP、db-c AMP治疗组,Gαi2/3蛋白表达下降,Gαs、c AMP、PKA蛋白表达明显上调。4免疫组织化学染色显示,经Ang II诱导24h后,与对照组相比,胞浆内有大量α-SMA阳性表达。给予Ac-SDKP和db-c AMP干预后,α-SMA阳表达明显减弱。而H89能够显著抑制Ac-SDKP和db-c AMP作用。Western blot结果显示,Ac-SDKP、db-c AMP干预能明显下调Ang II诱导的α-SMA、I型胶原和Fn的蛋白表达。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干预组α-SMA、I型胶原、Fn的蛋白表达明显上调。5 Western blot结果显示,给以Ac-SDKP、db-c AMP预处理,Gαi2/3蛋白的表达均较Ang II诱导组下调,Gαs的蛋白表达较Ang II诱导组上调。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干预组Gαi2/3蛋白表达明显升高,Gαs蛋白的表达明显降低。6免疫荧光染色检测α-SMA/PKA共表达结果显示,对照组PKA蛋白阳性表达于细胞浆及细胞核中,胞浆中α-SMA纤维状结构呈微弱表达或无表达。经Ang II诱导24h后,与对照组相比,PKA蛋白阳性表达减弱,α-SMA阳性表达则明显增强。给予Ac-SDKP和db-c AMP干预后,与Ang II组相比,PKA阳性表达明显增强,α-SMA阳性表达明显降低。而H89阻断了Ac-SDKP和db-c AMP的作用。Western blot结果显示,予以Ac-SDKP、db-c AMP干预后,与Ang II组比较,c AMP、PKA蛋白表达明显上调。Ac-SDKP+H89、db-c AMP+H89干预组c AMP、PKA蛋白表达下降。第三部分Ac-SDKP调节p CREB、p Smad2/3信号抑制矽肺纤维化的作用及机制目的:采用矽肺动物模型及体外细胞培养,观察Ac-SDKP抑制矽肺纤维化的作用是否与调控p CREB、p Smad2/3信号有关。方法:1采用HOPE-MED8050动式染尘控制系统构建大鼠矽肺模型,动物被随机分为:1)对照16周组;2)矽肺模型16周组;3)Ac-SDKP抗纤维化治疗组;4)Ac-SDKP预防治疗组;5)db-c AMP抗纤维化治疗组;6)db-c AMP预防治疗组。2大鼠肺成纤维细胞分别给予以下处理:1)正常对照组;2)Ang II(10-7mol/L)诱导组;3)Ang II+Ac-SDKP(10-8mol/L)组;4)Ang II+Ac-SDKP+H89(10-6mol/L)组;5)Ang II+db-c AMP(10-4mol/L)组;6)Ang II+db-c AMP+H89组。3采用Western blot检测矽肺组织及成纤维细胞中p CREB、CREB、p Smad2/3和Smad2/3的蛋白表达。免疫荧光染色法检测体内外p CREB/α-SMA、p Smad2/3与α-SMA的共表达,应用免疫共沉淀技术观察成纤维细胞核中p CREB、p Smad2/3与CREB结合蛋白(CREB binding protein,CBP)的相互作用。结果:1免疫组织化学染色结果显示,p CREB在肺泡上皮细胞中阳性表达较为显著,在矽结节内阳性表达减弱。而p Smad2/3在矽结节内阳性表达显著升高。免疫荧光化学染色显示,在正常对照组中,可见红色荧光标记的p Smad2/3蛋白微弱表达于细胞核中,α-SMA蛋白绿色荧光主要表达于气管平滑肌细胞。矽肺模型16周组,α-SMA蛋白主要表达于矽结节周围及肺泡壁增宽区域,p Smad2/3蛋白亦在上述部位的细胞核中表达明显增多,将两种荧光标记的蛋白图像组合后发现,纤维化病变区域的一些细胞胞浆内既有α-SMA蛋白阳性表达,又有细胞核中p Smad2/3蛋白的阳性表达。在Ac-SDKP及db-c AMP抗纤维化治疗和预防治疗组中,p Smad2/3蛋白和α-SMA蛋白阳性表达减弱。Western blot结果显示,在矽肺模型16周组p CREB蛋白表达下调,p Smad2/3蛋白表达明显上调。Ac-SDKP、db-c AMP治疗组,促进了p CREB蛋白表达,抑制了p Smad2/3蛋白表达。CREB、Smad2/3的蛋白表达无明显差异。2免疫荧光染色观察α-SMA/p CREB的共定位表达结果显示,在对照组,p CREB较多表达于细胞核,胞浆中亦有表达,而α-SMA呈微弱表达或无表达。经Ang II诱导24h后,细胞中p CREB阳性表达显著下降,α-SMA阳性表达则明显增强。分别给予Ac-SDKP和db-c AMP干预后,细胞中α-SMA表达明显减弱,p CREB阳性表达明显增强。H89能够显著抑制Ac-SDKP和db-c AMP的作用。免疫荧光染色结果还显示,Ang II能够显著增强细胞核中p Smad2/3表达及细胞浆中α-SMA的表达。Ac-SDKP及db-c AMP预处理,降低了成纤维细胞中p Smad2/3和α-SMA的共表达。H89能够显著阻断Ac-SDKP和db-c AMP的作用。Western blot结果显示,经Ang II诱导24h后,成纤维细胞p CREB的表达降低,p Smad2/3蛋白的表达显著增强。Ac-SDKP、db-c AMP预处理后明显促进了p CREB的表达,降低了p Smad2/3的蛋白表达。H89预处理取消了Ac-SDKP、db-c AMP的上述作用。CREB、Smad2/3的蛋白表达无明显差异。3成纤维细胞免疫共沉淀结果显示,CBP能够分别与p Smad2/3和p CREB结合。在Ang II诱导组,p Smad2/3与CBP的结合上调,而p CREB与CBP的结合降低。给予Ac-SDKP、db-c AMP预处理,促进了p CREB与CBP的结合,降低了p Smad2/3与CBP的结合。结论:1矽肺组织局部ACE/Ang II/AT1R在矽肺发生、发展过程中逐渐升高,并且体外Ang II能够刺激肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化;Ac-SDKP、c AMP的表达在矽肺发生、发展过程中呈下降趋势。Ac-SDKP与c AMP信号和Ang II信号参与了大鼠矽肺纤维化过程。2在矽肺组织及Ang II诱导的肌成纤维细胞转化中,Ac-SDKP可通过活化c AMP/PKA/p CREB信号抑制p Smad2/3的表达,且Ac-SDKP可促进p CREB/CBP复合物的形成,降低p Smad2/3与CBP的结合,抑制Smad信号,发挥其抗矽肺纤维化的作用。