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草甘膦是目前全球使用量最大、施用范围最广的除草剂，被广泛应用于农业和非农业领域。伴随着抗草甘膦转基因农作物的大面积种植和抗草甘膦杂草的出现，草甘膦的施用频次越来越多、使用量越来越大，预计到2020年，草甘膦的全球使用量将达到100万吨。由于长期、大量使用，环境中残留的草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸给生态环境安全和人类健康造成的潜在威胁不容忽视。
环境中残留的草甘膦和及其代谢物氨甲基膦酸能够通过饮用水、食物链和生产生活方式等途径进入人体，对人类健康造成威胁。但由于应用时间长、残留剂量低，草甘膦和氨甲基膦酸对人类健康造成的潜在威胁往往被忽视。本文将首先建立准确、灵敏、可靠的草甘膦和氨甲基膦酸的检测方法，为环境法医学实践、法医毒物分析和草甘膦中毒临床救治提供技术支持；其次，研究草甘膦和氨甲基膦酸在水和土壤中的吸附、迁移行为，为由草甘膦和氨甲基膦酸造成的环境污染防治提供技术支持；最后，采用体内和体外模型，研究草甘膦和氨甲基膦酸的毒性机制，为草甘膦和氨甲基膦酸中毒救治、法医毒物分析和环境法医案件调查取证提供基础数据。主要内容如下：
第一部分气相色谱同时检测草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸方法研究
目的：建立检测草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的气相色谱方法。
方法：选取三氟乙醇、五氟丙醇、七氟丁醇和三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐作为衍生化试剂与草甘膦和氨甲基膦酸进行三三交叉反应，采用气相色谱法-火焰光度检测器进行检测，选取最佳衍生化试剂组合。采用单因素实验和正交试验对影响衍生化反应的温度、时间和衍生化试剂比例进行优化，确定最佳衍生化条件。考察C18E、PEP-2(200mg, 6mL)、PEP-2(500mg, 6mL)、C18和SIM等五种不同类型固相萃取柱对样品中草甘膦和氨甲基膦酸的萃取效果，确定固相萃取柱类型，并对淋洗液和洗脱液的种类、体积进行优化。对水样、尿样、血样和土壤样品进行检测。
结果：在温度为90℃时，40μL七氟丁醇和60μL七氟丁酸酐作为衍生化试剂与草甘膦和氨甲基膦酸在进行反应，反应时间为50min。采用气相色谱-火焰光度检测器进行检测，草甘膦和氨甲基膦酸衍生化产物的达峰时间分别为5.4min和3.3min。草甘膦和氨甲基膦酸在10-1000ng/mL范围内线性关系良好，线性方程分别为y=9.3969x-20.237(r=0.9998)，y=4.2455x+9.4607(r=0.9991)，准确度为93.5-109.4%，精密度为1.3-5.5%，回收率为75.7-86.9%。草甘膦和氨甲基膦酸的检出限分别为0.10ng/mL、0.22ng/mL，定量限分为0.37ng/mL、0.81ng/mL。水样和土壤样品中均未检测出草甘膦和氨甲基膦酸。血浆样品中检测出草甘膦，最大浓度为842.13ng/mL。
小结：该方法简便、灵敏、可靠，可应用于水样、血样、尿样和土壤样品中的草甘膦和氨甲基膦酸含量测定。
第二部分草甘膦在水中降解和土壤对草甘膦及氨甲基膦酸吸附、迁移行为研究
目的：研究草甘膦在水中的降解规律和草甘膦及氨甲基膦酸在水-土壤中的吸附、迁移行为。
方法：配制pH=5、7、9的草甘膦水溶液，分别置于室外自然条件和室内恒温避光保存，考察pH、温度和光线对草甘膦降解的影响。采用吸附平衡实验，研究草甘膦和氨甲基膦酸在水-土壤两相中的吸附平衡时间。研究土壤对草甘膦和氨甲基膦酸的等温吸附。采用土柱实验，研究在降水淋溶作用下，草甘膦和氨甲基膦酸在土壤中的迁移行为。
结果：pH=5、7、9的草甘膦溶液在室外自然条件下，1年的降解率分别为20.3%、15.6%、7.9%；在室内避光条件下，1年的降解率分别为6.2%、4.8%、3.3%。草甘膦在水-土壤两相的吸附平衡时间为10h。土壤对草甘膦和氨甲基膦酸的等温吸附过程符合Freundlich方程，回归方程分别为lnCs=0.6271lnCe+4.2607，lnCs=0.6095lnCe+4.4601。在200mm降水淋溶作用下，迁移实验结果：草甘膦和氨甲基膦酸最大浓度出现在4.0-4.5cm深土层。在1200mm降水淋溶作用下，迁移实验结果：草甘膦和氨甲基膦酸在土壤中的迁移深度＞20cm。
小结：光线增强、温度升高、pH降低加速草甘膦在水中的降解。草甘膦和氨甲基膦酸在水-土壤两相中的吸附平衡时间为10h。土壤对草甘膦和氨甲基膦酸的等温吸附过程符合Freundlich方程。草甘膦和氨甲基膦酸在降水淋溶作用下向土壤深层迁移。
第三部分草甘膦和氨甲基膦酸的细胞毒性和斑马鱼胚胎发育毒性研究
目的：研究1、10、100、700ng/mL的草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸对HepG2细胞、AC16细胞的毒性和斑马鱼胚胎发育毒性。
方法：采用MTT法检测1、10、100、700ng/mL草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸染毒48h后，HepG2细胞和AC16细胞的存活率，并对细胞内ATP含量进行测定。1、10、100、700ng/mL草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸染毒72h后，对斑马鱼胚胎的存活率、孵化率、畸形率、心率、相关基因、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量等进行检测。
结果：1、10、100、700ng/mL草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸染毒48h后，随着染毒剂量的增加，HepG2细胞和AC16细胞的存活率下降，细胞内ATP含量降低。1、10、100、700ng/mL草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸染毒72h后，斑马鱼胚胎出现不同程度的形态学变化。随着染毒剂量的增加，斑马鱼胚胎存活率和孵化率降低、畸形率升高、心率加快、相关基因表达发生改变、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量降低。
小结：草甘膦和氨甲基膦酸能够诱导HepG2细胞和AC16细胞出现毒性损伤，干扰细胞能量代谢。草甘膦和氨甲基膦酸对斑马鱼胚胎具有发育毒性和心脏毒性。
环境中残留的草甘膦和及其代谢物氨甲基膦酸能够通过饮用水、食物链和生产生活方式等途径进入人体，对人类健康造成威胁。但由于应用时间长、残留剂量低，草甘膦和氨甲基膦酸对人类健康造成的潜在威胁往往被忽视。本文将首先建立准确、灵敏、可靠的草甘膦和氨甲基膦酸的检测方法，为环境法医学实践、法医毒物分析和草甘膦中毒临床救治提供技术支持；其次，研究草甘膦和氨甲基膦酸在水和土壤中的吸附、迁移行为，为由草甘膦和氨甲基膦酸造成的环境污染防治提供技术支持；最后，采用体内和体外模型，研究草甘膦和氨甲基膦酸的毒性机制，为草甘膦和氨甲基膦酸中毒救治、法医毒物分析和环境法医案件调查取证提供基础数据。主要内容如下：
第一部分气相色谱同时检测草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸方法研究
目的：建立检测草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的气相色谱方法。
方法：选取三氟乙醇、五氟丙醇、七氟丁醇和三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐作为衍生化试剂与草甘膦和氨甲基膦酸进行三三交叉反应，采用气相色谱法-火焰光度检测器进行检测，选取最佳衍生化试剂组合。采用单因素实验和正交试验对影响衍生化反应的温度、时间和衍生化试剂比例进行优化，确定最佳衍生化条件。考察C18E、PEP-2(200mg, 6mL)、PEP-2(500mg, 6mL)、C18和SIM等五种不同类型固相萃取柱对样品中草甘膦和氨甲基膦酸的萃取效果，确定固相萃取柱类型，并对淋洗液和洗脱液的种类、体积进行优化。对水样、尿样、血样和土壤样品进行检测。
结果：在温度为90℃时，40μL七氟丁醇和60μL七氟丁酸酐作为衍生化试剂与草甘膦和氨甲基膦酸在进行反应，反应时间为50min。采用气相色谱-火焰光度检测器进行检测，草甘膦和氨甲基膦酸衍生化产物的达峰时间分别为5.4min和3.3min。草甘膦和氨甲基膦酸在10-1000ng/mL范围内线性关系良好，线性方程分别为y=9.3969x-20.237(r=0.9998)，y=4.2455x+9.4607(r=0.9991)，准确度为93.5-109.4%，精密度为1.3-5.5%，回收率为75.7-86.9%。草甘膦和氨甲基膦酸的检出限分别为0.10ng/mL、0.22ng/mL，定量限分为0.37ng/mL、0.81ng/mL。水样和土壤样品中均未检测出草甘膦和氨甲基膦酸。血浆样品中检测出草甘膦，最大浓度为842.13ng/mL。
小结：该方法简便、灵敏、可靠，可应用于水样、血样、尿样和土壤样品中的草甘膦和氨甲基膦酸含量测定。
第二部分草甘膦在水中降解和土壤对草甘膦及氨甲基膦酸吸附、迁移行为研究
目的：研究草甘膦在水中的降解规律和草甘膦及氨甲基膦酸在水-土壤中的吸附、迁移行为。
方法：配制pH=5、7、9的草甘膦水溶液，分别置于室外自然条件和室内恒温避光保存，考察pH、温度和光线对草甘膦降解的影响。采用吸附平衡实验，研究草甘膦和氨甲基膦酸在水-土壤两相中的吸附平衡时间。研究土壤对草甘膦和氨甲基膦酸的等温吸附。采用土柱实验，研究在降水淋溶作用下，草甘膦和氨甲基膦酸在土壤中的迁移行为。
结果：pH=5、7、9的草甘膦溶液在室外自然条件下，1年的降解率分别为20.3%、15.6%、7.9%；在室内避光条件下，1年的降解率分别为6.2%、4.8%、3.3%。草甘膦在水-土壤两相的吸附平衡时间为10h。土壤对草甘膦和氨甲基膦酸的等温吸附过程符合Freundlich方程，回归方程分别为lnCs=0.6271lnCe+4.2607，lnCs=0.6095lnCe+4.4601。在200mm降水淋溶作用下，迁移实验结果：草甘膦和氨甲基膦酸最大浓度出现在4.0-4.5cm深土层。在1200mm降水淋溶作用下，迁移实验结果：草甘膦和氨甲基膦酸在土壤中的迁移深度＞20cm。
小结：光线增强、温度升高、pH降低加速草甘膦在水中的降解。草甘膦和氨甲基膦酸在水-土壤两相中的吸附平衡时间为10h。土壤对草甘膦和氨甲基膦酸的等温吸附过程符合Freundlich方程。草甘膦和氨甲基膦酸在降水淋溶作用下向土壤深层迁移。
第三部分草甘膦和氨甲基膦酸的细胞毒性和斑马鱼胚胎发育毒性研究
目的：研究1、10、100、700ng/mL的草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸对HepG2细胞、AC16细胞的毒性和斑马鱼胚胎发育毒性。
方法：采用MTT法检测1、10、100、700ng/mL草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸染毒48h后，HepG2细胞和AC16细胞的存活率，并对细胞内ATP含量进行测定。1、10、100、700ng/mL草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸染毒72h后，对斑马鱼胚胎的存活率、孵化率、畸形率、心率、相关基因、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量等进行检测。
结果：1、10、100、700ng/mL草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸染毒48h后，随着染毒剂量的增加，HepG2细胞和AC16细胞的存活率下降，细胞内ATP含量降低。1、10、100、700ng/mL草甘膦、氨甲基膦酸、草甘膦联合氨甲基膦酸染毒72h后，斑马鱼胚胎出现不同程度的形态学变化。随着染毒剂量的增加，斑马鱼胚胎存活率和孵化率降低、畸形率升高、心率加快、相关基因表达发生改变、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶含量降低。
小结：草甘膦和氨甲基膦酸能够诱导HepG2细胞和AC16细胞出现毒性损伤，干扰细胞能量代谢。草甘膦和氨甲基膦酸对斑马鱼胚胎具有发育毒性和心脏毒性。