茯苓多糖硫酸酯制备方法及其抗肿瘤活性研究

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多糖活性与其分子结构、分子量、溶解性等因素紧密相关,结构对活性的影响是关键的。为提高或赋予多糖活性,多糖分子化学结构修饰具有重要意义。硫酸化多糖是天然来源或经人工改造的生物大分子物质,具有诸多生物活性,如:抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化、抗肾衰等。真菌茯苓是我国传统的用于利尿和镇定的中药。茯苓聚糖是茯苓主要成分,占茯苓干燥菌核90%以上,开发利用茯苓多糖资源有极大的经济价值,但由于茯苓多糖不溶于水,有必要对其进行结构改造以发挥其生物活性。   本文利用碱提酸沉法提取茯苓菌核多糖,分别以氯磺酸(改良Wolfrom法)和氨基磺酸为硫酸化试剂制备茯苓多糖硫酸酯(PS)。通过单因子和正交实验,研究茯苓多糖硫酸化反应工艺,通过波谱学特征分析,研究PS分子结构。以S180肿瘤模型小鼠和Yac-1肿瘤细胞株分别为体内和体外实验对象,研究PS抗肿瘤活性和免疫调节功能。   本文提取茯苓多糖得率为77.8%,苯酚-硫酸法检测多糖含量为99.2%,25℃时DMSO溶液中特征粘度[η]为78.95mL.g-1,粘均分子量为2.15×105Da。   以一种改良Wolfrom方法将茯苓多糖和氯磺酸反应制备茯苓多糖硫酸酯PS-1。制备PS-1单因子实验和正交实验结果表明,茯苓多糖硫酸化反应条件宜控制在:氯磺酸/单糖残基摩尔比(A)3-5、反应时间(B)1-2h、反应温度(C)60-80℃,产物DS变化在0.47-1.55间,[η]变化在71.4mL/g-32.6mL/g间,影响DS和特征粘度的主次顺序是:A>C>B。13C-NMR图谱表明,PS-1系列之一的C-6羟基被全部酯化,C-2和C-4羟基发生部分硫酸酯化反应。   以氨基磺酸制备PS-2单因子实验和正交实验结果表明,以氨基磺酸为硫酸化试剂制备茯苓多糖硫酸酯的反应条件宜控制在:氨基磺酸/单糖残基摩尔比(A)4-6、反应时间(B)1-3h、反应温度(C)80-100℃,产物DS变化在0.95-2.68间,分子量变化在120,581-8,913Da间,[η]变化在124.6-13.9mL/g间。影响DS和分子量的主次顺序是:C>B>A。PS-2系列之一的波谱分析结果表明C-2和C-6羟基发生部分硫酸酯化反应。   IR图谱显示PS硫酸基的特征吸收峰,O-H伸缩振动峰宽变窄,变窄的幅度与DS成正比;NMR图谱显示茯苓多糖碳原子化学位移发生显著变化,PS的DS越大,碳原子化学位移发生的移动就越大。   PS体外可显著提高NK细胞杀伤活性(P<0.001),体内显著抑制移植性S180肿瘤生长,最大抑瘤率达32.22%(P<0.005)。显著促进荷瘤小鼠脾脏和胸腺淋巴器官发育生长(P<0.05),体外对小鼠淋巴细胞尤其是B淋巴细胞增殖有显著促进作用(P<0.05),表明Ps可以通过促进淋巴细胞增殖,增强机体特异性免疫功能而发挥抗肿瘤作用。PS可以拮抗免疫抑制药所致的免疫抑制。  
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