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丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种主要经血液传播的疾病,丙型肝炎病毒呈全球性流行,据统计,全球约有1.85亿人为HCV感染者。我国属HCV高感染区,丙型肝炎报告数在病毒性肝炎中也呈上升趋势。HCV的基因型分布复杂,呈明显的地域差异性。目前HCV已发现8种基因型80多种亚型,我国以1b、2a型最常见。目前,针对HCV的直接抗病毒药物(DAA)已经应用于临床,该药具有强效抑制病毒复制,快速降低HCV病毒载量,提高了丙型肝炎治疗的持续病毒应答(SVR)。然而,随着DAA药物的广泛使用,加上HCV病毒复制时的高错配率和RNA聚合酶低保真性等特性致使HCV在DAA药物的压力下产生了耐药基因的突变,进而影响了丙肝治疗效果。HCV相关耐药基因突变又与HCV不同基因型和亚型直接相关。因此,阐明HCV基因型和亚型的分布以及耐药突变基因特征对丙肝的临床治疗具有重要的指导意义。此外,针对HCV DAA耐药突变的检测目前主要通过一代测序(Sanger)的方法,该方法具有灵敏度低、信息量小等不足也制约了HCV耐药位点的监测。基于此,本论文研究了云南地区HCV基因型和亚型流行特征,建立了基于新一代测序技术(NGS)HCV耐药突变基因的检测方法。首先,本论文研究了2018年云南地区的1464例样本,结果表明HCV基因型以3b(39.3%)、1b(21.0%)、3a(20.0%)、6n(8.8%)、2a(7.2%)、6a(2.1%),呈现出3b、3a和1b为主的分布特征。此外,我们针对昆明地区2008-2018年503例HCV阳性样本11年来基因型动态变化进行了分析,结果表明总体HCV基因型分布情况为3b(37.6%),3a(21.9%),1b(19.3%),2a(10.5%),6n(7.2%)。其中1b由2008年的13%到2018年的4%、2a由2008年的10%到2018年的0%均呈明显的逐年下降趋势。相反,3a从2008年的3%到2018年的16%、3b从2008年的9%到2018年的24%均呈明显的逐年上升趋势。其次,为了调查云南地区HCV治疗前耐药突变的流行特征,我们随机选取主要流行的HCV 1b(60例)、3a(60例)、3b(60例)、2a(30例)、6n(40例)。利用RT-PCR方法针对DAA作用靶点基因NS3、NS5A、NS5B进行了测序分析。结果表明,HCV 1b的NS3区容易发生M/V170I(54.5%)对波普瑞韦、M/V170I(52.7%)对西咪匹韦、M/V170I(52.7%)对特拉匹韦、M/V170I(52.7%)伏西瑞韦发生抗性耐药;NS5A区容易发生L28M(42.6%)而对达卡他韦、雷迪帕韦、奥比他韦发生抗性耐药;NS5B区容易发生C/R316N(80.4%)而对达塞布韦产生抗性耐药。3a的NS3区容易发生H170I(98.2%)而对伏西瑞韦产生抗性耐药。3b的NS3区容易发生H170I(98.1%)而对伏西瑞韦产生抗性耐药;NS5A区容易发生Q30K(100%)而对艾尔巴韦、雷迪帕韦、维拉他韦发生抗性耐药,D/G31M(98.1%)而对达卡他韦、艾尔巴韦发生抗性耐药。最后,我们针对云南地区HCV六种主要流行基因亚型(1b、2a、3a、3b和6n),根据HCV NS3、NS5A和NS5B三个区段耐药位点分布的特点,设计了50对多重PCR引物进行模板扩增,NGS检测结果表明高通量测序可以检出Sanger测序未检出的低频率耐药突变位点,其他位点两种检测方法结果基本一致且NGS测序检出的突变频率为100%。此外,我们还进行了特异性验证,结果说明此方法中设计的多重PCR引物对HCV病毒基因组具有特异性,说明HCV耐药突变基因下一代测序方法的初步建立。综上所述,本论文阐明了云南地区目前HCV基因型和亚型的分布特征,以及昆明地区HCV基因型和亚型11年来的变化规律,为HCV患者的治疗和预防提供了科学依据。此外,我们首次研究了云南地区DAA治疗前HCV主要流行基因型和亚型预存耐药突变特征,并初步建立了基于NGS技术HCV不同基因型亚型耐药突变基因检测方法,为下一步准确监控HCV DAA治疗中耐药突变提供了重要的技术手段。