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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种全身性、慢性自身免疫性疾病,除造成关节滑膜增生、软骨和骨破坏外,可累及心脏、肺等全身各个重要脏器。RA的主要病理特征为滑膜炎、血管翳形成、滑膜增生、骨和软骨损伤。增生的滑膜组织中有2/3的细胞为成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）,它是RA的关键效应细胞,不仅能产生免疫应答、刺激炎症反应,而且可以直接对骨和软骨侵蚀,在RA的发病中起重要作用。文献报道,RA患者滑膜组织中存在大量PGE2（prostaglandin E2,PGE2）,多种关节炎动物模型证实,PGE2-EP4信号通路在关节炎的发生发展中起重要作用,引起FLS异常增殖,直接导致滑膜异常增生。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,简称G蛋白,是一种细胞内普遍存在的信号分子,发挥重要的跨膜信号转导功能,由α,β,γ三种亚基组成,与相应G蛋白偶联受体（GProtein-Coupled receptors,GPCRs）偶联。当 GPCRs 被激活发生构象改变,引起G蛋白α亚基与βγ亚基解离,Gβγ二聚体可与G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptor kinases,GRKs）,PI3K 等下游效应分子结合。GPCRs 的脱敏和复敏调节受体功能,GRKs与GPCRs脱敏相关。研究表明,在RA动物模型中,PGE2通过EP4-GRK2-Gαi-cAMP信号通路引起GRK2过度转膜,EP4脱敏,促进FLS异常增殖。GPCRs-Gβγ-GRKs复合物对受体功能的调节和GRKs的催化作用至关重要,这在肾上腺素受体和阿片受体中已被研究,但在EP4受体中未见报道。芍药苷-6’-氧-苯磺酸酯（CP-25）是芍药苷经酯化后得到的小分子新型活性单体,能减轻大鼠佐剂性关节炎（adjuvant arthritis,AA）的关节炎症和骨质破坏,抑制FLS中GRK2转膜和EP4脱敏,缓解FLS异常增殖,但CP-25对GRK2-EP4信号的作用是否有Gβγ的参与及具体机制目前尚不明确。目的:探究RA患者的滑膜组织及FLS中EP4,Gβγ和GRK2的变化和结合情况,明确上述变化与FLS异常增殖和迁移的关系,在FLS中阐明Gβγ与GRK2的相互作用在EP4脱敏和Gβγ下游信号转导中的作用,阐明CP-25通过影响Gβγ与GRK2的相互作用发挥抑制FLS异常活化的机制。方法:1.收取创伤患者和RA患者的滑膜组织,用H＆E染色观察RA患者滑膜病理,用Western blot法检测COX-2表达,ELISA法观察关节滑液PGE2含量,组织免疫组化和Western blot法检测GRK2,EP4和Gβ的表达,Western blot法检测GRK2,EP4和Gβ的膜表达,用免疫荧光和免疫共沉淀法检测Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达。2.用完全弗氏佐剂建立大鼠AA模型,提取AA-FLS,从RA患者滑膜组织提取RA-FLS,在PGE2刺激基础上,给予CP-25和Gβγ抑制剂Gallein作用RA-FLS和AA-FLS,用CCK-8和Transwell法检测PGE2刺激后的细胞增殖和迁移,用Western blot法检测GRK2,EP4和Gβ的膜表达,用免疫荧光和免疫共沉淀法检测Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达。3.用不同时程PGE2刺激MH7A细胞系,在PGE2刺激基础上,给予CP-25和Gβγ抑制剂Gallein作用MH7A,用CCK-8和Transwell法检测PGE2刺激后的细胞增殖和迁移,用Western blot法检测GRK2,EP4和Gβ的膜表达,用免疫荧光和免疫共沉淀法检测Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达。4.用siRNA沉默MH7A的Gβ1亚基,用CCK-8和Transwell法检测转染后MH7A细胞在PGE2刺激下的增殖和迁移的变化,用Western blot法检测GRK2,EP4和Gβ的膜表达,用免疫荧光检测GRK2与EP4的共表达。5.在PGE2刺激基础上,给予Gβγ激活剂mSIRK和抑制剂GRK2i,用CCK-8和Transwell法检测细胞的增殖和迁移,用Western blot法检测GRK2,EP4和脱敏相关蛋白β-arrestin2的膜表达,用免疫荧光和免疫共沉淀法检测Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达。6.用Western blot法检测RA滑膜组织和MH7A中PI3K,Akt,GSK-3β的表达,用免疫共沉淀法检测Gβ与PI3K的共表达。结果:1.RA患者滑膜组织和RA-FLS中PGE2-EP4-Gβγ-GRK2信号通路的检测及CP-25的作用滑膜病理结果显示,与创伤患者相比,RA患者滑膜增生,滑膜组织中COX-2表达增加,关节滑液中PGE2含量增多。RA组滑膜组织中GRK2的总表达、GRK2及Gβ的细胞膜表达增多,EP4膜表达减少,Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达增多。制备RA-FLS,用免疫荧光法行Vimentin和CD55双标阳性鉴定。PGE2刺激促进RA-FLS增殖和迁移,GRK2和Gβ的细胞膜表达增加,EP4膜表达降低,Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达增多;CP-25和Gβγ抑制剂Gallein能够抑制PGE2诱导的RA-FLS异常增殖和迁移,降低GRK2和Gβ的膜表达,升高EP4膜表达,抑制Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达。2.AA-FLS中PGE2-EP4-Gβγ-GRK2信号通路的检测及CP-25的作用成功构建AA模型,造模后大鼠关节肿胀,关节炎指数升高。制备AA-FLS,用免疫荧光法行Vimentin和CD55双标阳性鉴定。PGE2刺激促进AA-FLS增殖和迁移,GRK2和Gβ的细胞膜表达增加,EP4膜表达降低,Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达增多;CP-25和Gallein抑制PGE2诱导的AA-FLS异常增殖和迁移,降低GRK2和Gβ的膜表达,升高EP4膜表达,抑制Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达。3.MH7A细胞中PGE2-EP4-Gβγ-GRK2信号通路的检测及CP-25的作用PGE2短时程刺激MH7A细胞10min,GRK2和EP4的总表达增加,GRK2、Gβ、EP4的细胞膜表达增加,Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达增多,CP-25抑制GRK2和EP4的总表达,降低GRK2、Gβ、EP4的膜表达,抑制Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达。PGE2长时程刺激MH7A细胞24h,促进细胞增殖和迁移,GRK2和Gβ的细胞膜表达增加,EP4膜表达降低,Gβ与GRK2,Gβ与EP4,GRK2与EP4的共表达增多,CP-25和Gallein抑制PGE2诱导的MH7A细胞异常增殖和迁移,下调Gβ和GRK2的总表达和膜表达,上调EP4的总表达和膜表达,削弱Gβ与GRK2,Gβ 与 EP4,GRK2 与 EP4 的共表达。用siRNA瞬时沉默MH7A细胞的Gβ1亚基,转染后PGE2诱导的增殖和迁移能力减弱,GRK2的总表达和膜表达未升高,EP4的膜表达未降低,GRK2与EP4的共表达减弱;给予MH7A细胞Gβγ抑制剂GRK2i处理后,PGE2诱导的细胞增殖和迁移减弱,GRK2和β-arrestin2的膜表达降低,EP4膜表达增加,GRK2和EP4的相互作用增降低;用Gβγ激活剂mSIRK对MH7A细胞处理后,PGE2诱导的细胞增殖和迁移加强,GRK2和β-arrestin2的膜表达升高,EP4膜表达降低,GRK2和EP4的相互作用增强。4.CP-25对Gβγ下游PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响RA患者滑膜组织Gβ与PI3K的共表达增强,PI3K的表达上调,磷酸化Akt和磷酸化GSK-3β的比值增多。PGE2刺激后,MH7A细胞的Gβ与PI3K的共表达增强,PI3K膜表达增加,磷酸化Akt和磷酸化GSK-3β的比值增多;在PGE2刺激基础上给予CP-25和Gallein,Gβ与PI3K的共表达减弱,PI3K膜表达降低,磷酸化Akt和磷酸化GSK-3β的比值降低。结论:1.RA 中 PGE2-EP4-Gβγ-GRK2 信号通路激活,Gβγ 与 GRK2,Gβγ 与 EP4 的相互作用增强,促进GRK2与EP4的结合,引起GRK2转膜,EP4脱敏,与RA滑膜增生及FLS异常增殖和迁移有关。2.Gβγ参与PGE2诱导的FLS异常增殖和迁移,抑制Gβγ后,GRK2与EP4的结合减弱,EP4复敏,恢复FLS正常的增殖和迁移功能。3.CP-25通过调控EP4-Gβ γ-GRK2信号通路,使EP4复敏,抑制PGE2诱导的FLS异常增殖和迁移。4.CP-25抑制PGE2诱导的FLS异常增殖和迁移作用,与其调控Gβγ下游PI3K/Akt/GSK-3β信号通路有关。