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百草枯(PQ)是一种水溶型除草剂,因其易于被土壤吸附、在环境中残留量相对较低和具有良好的除草效果,PQ先后在全球120多个国家被广泛使用。但自1962年注册生产以来,PQ已经引起了严重的公共健康问题,由 PQ导致的自杀、谋杀、误服以及生产和使用接触的中毒死亡事件时有报道,而PQ的毒性机制至今仍不清楚,目前针对PQ中毒也没有的良好治疗策略和高效解毒剂。 通过对PQ中毒病人、死者和动物进行研究,人们发现体内蓄积的PQ主要存在于肺,而肾作为水溶物质的排泄器官,其在PQ中毒之后发生的变化也被大量调查。此外,近年来的慢性毒性实验发现,PQ引起的部分病理特征与一些早老疾病症状相似,随之PQ的神经毒性也引起了人们的广泛关注。但PQ中毒对人肝的影响一直未被深入探讨。 众所周知,肝是机体最重要的解毒器官,在外源毒物的降解过程中发挥着举足轻重的作用,因此解明肝在PQ处理后发生的变化对全面理解PQ的毒性效应及机制具有重要意义,也有利于寻找新的方法提高肝对PQ的抵抗力、增强肝对PQ中毒的消解作用。人肝癌细胞 HepG2具有肝细胞的多种代谢和转化酶系,是良好的肝细胞研究模型,故本文以 HepG2细胞作为实验材料,运用一系列细胞和分子生物学新技术开展研究,探讨PQ对HepG2细胞的毒性效应及可能机制。 首先,本研究从细胞水平上,采用6种方法,选择存活力、生长状况、周期、凋亡和突变5个指标评估了PQ处理24 h对HepG2细胞的毒性效应。其中,MTT实验结果显示PQ对HepG2细胞存活力的24 h-IC50为51.17 mg/L,显微观察发现7.21 mg/L的PQ即可导致细胞的形态结构发生病理性改变、贴壁能力下降、生长受到抑制,BrdU和PI双色流式实验检测到23.36 mg/L的PQ即可导致细胞周期停滞(S期细胞减少、G1和G2期细胞增多),annexin V和PI双色流式实验检测到7.21 mg/L的PQ即可诱导细胞凋亡,微核(MN)和姊妹染色单体交换(SCE)实验结果表明7.21 mg/L的PQ可导致HepG2细胞的突变率大大提高,HepG2细胞发生的这些毒性效应的程度均与PQ处理浓度呈正相关。此外,本研究在MN实验操作之前对HepG2细胞进行了低渗处理,结果提高了MN图像的分辨力,这对于增加同类细胞MN实验的准确率和效率均具有重要意义。 随后,本研究从分子水平上,调查了PQ处理24 h对HepG2细胞基因组DNA稳定性的影响,以分析PQ对HepG2细胞毒性效应的可能机制。单细胞凝胶电泳、随机扩增多态性和高效液相色谱(HPLC)实验结果显示,PQ可导致HepG2细胞发生明显的基因组DNA断裂损伤、多态性下降和甲基化升高,且基因组的这些变化与PQ处理浓度呈正相关。定量PCR和免疫印迹实验的结果表明,HepG2细胞内抑制断裂双链DNA(dsDNA)进行同源重组(HR)修复的细胞因子BLM和DNA ligase I的表达量随PQ处理浓度增大而减少,即PQ处理后HR修复增强,这表明HepG2细胞对PQ导致的基因组不稳定有明显的应激反应,该反应也合理地解释了PQ导致的SCE频率增高;而HepG2细胞内促进断裂dsDNA进行非同源末端连接(NHEJ)修复的细胞因子Ku70的表达量随PQ处理浓度增大呈先增多后减少变化,NHEJ修复的先增强显然也是HepG2细胞对PQ导致基因组不稳定性产生的应激反应,但后减弱则意味着NHEJ修复最终走向崩溃,难以挽救PQ导致的基因组不稳定。 进一步,采用流式细胞术、HPLC和 ELISA等方法系统评价了 PQ处理后 HepG2细胞发生的氧化应激反应和氧化损伤。结果显示,低浓度PQ处理组HepG2细胞超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力有所提高,所有PQ处理组HepG2细胞内氧化型谷胱甘肽含量均增多,表明 HepG2细胞对 PQ导致的氧化损伤产生了应激反应;但同时发现所有PQ处理组HepG2细胞内活性氧和丙二醛含量均较多,表明氧化应激反应不足以平衡氧化损伤;因此同时检测到PQ处理组DNA氧化产物8-羟基脱氧鸟苷的含量明显多于正常组。DNA发生氧化损伤可能正是PQ导致HepG2细胞基因组不稳定的直接原因。 最后,采用火焰原子吸收法检测到PQ处理导致HepG2细胞内Ca、Mg和Zn含量失衡。其中,Ca的含量增加可能是Ca活化途径介导细胞凋亡的体现,不利于细胞存活;Mg含量的减少则会阻滞细胞生长和分裂,同时不利于基因组的稳定;而Zn含量的减少不仅会促进细胞凋亡,而且不利于基因组稳定性的维持和DNA氧化损伤的防止。 综上所述,PQ处理可能首先导致HepG2细胞发生了严重的DNA氧化损伤和Ca、Mg及Zn含量的失衡,进而引起基因组稳定性下降,最终抑制了细胞的正常存活、生长和增殖,诱导细胞发生凋亡或突变。尽管HepG2细胞对PQ刺激表现出一定程度的DSB修复增强和抗氧化应激,但不足以解除PQ的细胞毒性。