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我们前面的工作已经证明TaSI1和TaSC基因是受盐诱导表达的,且通过异源转化实验证明这两个基因能够提高拟南芥的耐盐性。其中TaSI1是通过双向电泳的方法获得的,在耐盐材料RH8706-49和敏盐材料RH8706-34中盐诱导后表达均上调的基因。TaSC基因是通过cDNA-AFLP得到G09-94号差异cDNA序列的基础上,通过EST比对进行电子克隆得到的。由于水稻与小麦的进化关系更接近,本实验通过在水稻中分别过表达这两个基因,进一步研究了其耐盐性。选用pTCK303作为实施过表达的双元载体,分别构建了pTCK303-TaSI1、pTCK303-TaSC过表达载体,并进一步转化水稻。
我们知道同源基因在生物体内所发挥的功能基本上是相同的,因此我们通过在NCBI网站进行同源比对分别找到了小麦TaSI1和TaSC基因的同源基因,并分别命名为OsSI和OsSC。在实验中进一步通过RNAi的手段研究水稻中这两个基因的功能,从另一方面证明TaSI1和TaSC基因的耐盐性。我们选用pTCK303作为实施RNAi策略的双元载体。在OsSI和OsSC基因中选取特异的一段cDNA作为RNA干涉的片段,分别命名为OsSIi和OsSCi,测序正确后分两次酶切连接,将RNAi片段先正向后反向两次连入pTCK303质粒中,完成pTCK303-OsSIi、pTCK303-OsSCi的构建。
构建完成的双元载体通过农杆菌介导的方法转化水稻,经共培养、选择培养、分化培养后得到T0代转基因植株。得到的转基因株系如下:pTCK303-OsSIi为27个、pTCK303-TaS11为20个、pCAMBIA1300 ProTaS11∷GUS为11个,pTCK303-OsSCi为14个、pTCK303-TaSC为19个、pTCK303空载体为4个。
我们通过Real time-PCR方法检测了OsSI和OsSC基因RNA干涉株系的转录本.其中OsSI基因的两个转基因株系line i-3、i-4分别下降了50％、70％；OsSC基因的三个转基因株系line i-1、i-2、i-20分别下降了20％、25％、50％、,说明RNA干涉实验成功。同时通过半定量RT-PCR检测了TaSI1和TaSC基因过表达植株的转录本,其中TaSI1基因的四个转基因株系OX-1、OX-2、OX-5、OX-9mRNA量均显著上升；TaSC基因OX-10 mRNA量上升明显,但OX-1、OX-2两个转基因株系虽然也表达了TaSC基因,但mRNA量上升幅度不大。
进而对转基因植株的T1代进行了耐盐性分析,TaSI1基因三个过表达植株OX-2、OX-5、OX-9比对照长势好,且存活率比空载体高20％左右,这与前面所检测的过表达植株的mRNA量的结果是一致的:TaSC基因三个过表达植株中OX-1、OX-2二个株系与对照长势并没有明显的差异,且存活率与空载体相似,OX-10存活率则比对照高不到20％,这与前面所检测的过表达植株的mRNA量的结果也是一致的。同时对OsSI和OsSC基因RNAi植株的T1代进行了耐盐性分析,结果表明OsSI RNAi的两个株系i-3和i-4长势明显不如对照,且存活率低于对照:OsSC基因RNAi的三个株系i-1、i-2、i-20存活率明显低于对照,两个基因的表型与mRNA的表达程度也是一致的。
同时通过对TaSI1基因进行组织化学定位分析表明,该基因在愈伤、茎、茎节、叶舌、雄蕊、芽中均有表达,在根和叶中不表达。