论文部分内容阅读
产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起旅行者、儿童及幼龄动物腹泻的主要病原菌之一,其引起的仔猪黄痢、仔猪白痢和断奶仔猪腹泻严重影响仔猪的健康,给养猪业造成了巨大经济损失。由于耐药菌株的出现使抗生素疗效明显下降,因此,生产上迫切需要新型、高效的药物或疫苗来保障仔猪哺乳期的健康。口服疫苗具有诱导肠道局部黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫的优点,为仔猪大肠杆菌病疫苗研究提供了新思路。ETEC产生的肠毒素主要有热不稳定肠毒素（Heat-labile enterotoxin,LT）和热稳定肠毒素（Heat-stable enterotoxin,ST）,是主要致病因子。LT虽具有良好的抗原性,但自身的毒性限制了其作为抗原被直接用于动物的免疫。减毒LT突变体（Mutant heat-labile enterotoxin,mLT）的研究已有报道,但不同mLT突变菌株的构建及其生物学特性尚缺乏系统研究。本研究构建了3株产肠毒素性大肠杆菌的mLT突变菌株,旨在通过对其主要生物学特性系统地比较研究,为仔猪大肠杆菌性腹泻口服疫苗的研制筛选出较理想的候选菌株。本研究选择E.coli C83903（K88、STb、LT）为初始菌株,使用CRISPR/Cas9双质粒基因编辑系统敲除est B基因获得E.coli C83903（35）est B后,对编码LT的基因elt定点突变,分别构建了E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、和E.coli mLT-R192G。经实验检测,3株突变菌在连续50次传代后基因突变位点遗传稳定;细菌生长曲线、菌毛的生长、对IPEC-J2细胞的黏附等生物学特性与初始菌比较无明显差异;耐药性无改变;对p H>2.5的胃液环境和0.3%的胆汁环境有良好的耐受性。为检测LT和mLT,本研究构建了E.coli p ET-32a-S1-BL21、E.coli p ET-32a-S2-BL21重组菌,表达纯化了重组蛋白LTA-S1、LTA-S2,免疫家兔并制备了兔抗LTA-S1和兔抗LTA-S2血清,其中兔抗LTA-S1血清效价较高,用于后续LT和mLT的检测。兔肠袢结扎试验和兔肠组织切片观察结果显示,3种不同mLT均有一定的肠毒性,其中E.coli mLT-S63K产生的mLT肠毒性最弱,且对肠组织造成的损伤最轻。Y1细胞毒性试验结果显示,E.coli mLT-S63K产生的mLT对Y1细胞的毒性最弱,毒力效价为103.48 TCID50/0.1m L,是初始菌E.coli C83903产生的LT毒性的1/10 000(107.61 TCID50/0.1m L)。将5周龄BALB/c小鼠随机分为6组（A、B、C、D、E、F）,每组25只,连续3天分别灌胃0.3 m L无菌PBS,3×1010CFU的E.coli C83903（35）est B（35）eltⅠ、E.coli C83903（35）est B、E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、E.coli mLT-R192G,间隔2 w共免疫3次。检测结果与对照组比较表明,突变菌对小鼠采食量、体重无影响,对回肠组织无损伤,安全性良好;用间接ELISA检测各组小鼠血清、肠黏液中特异性Ig G和s Ig A水平,结果显示,在初次免疫后的第14 d,从实验组小鼠血清和肠黏液检测到针对LTA-S1蛋白的特异性Ig G和s Ig A,抗体水平显著高于对照组（p<0.05）,其中E.coli mLT-R192G组在第35 d检测到的Ig G水平显著高于其他组（p<0.05）,而E.coli mLT-S63K组在第42 d检测到的s Ig A水平显著高于其他组（p<0.05）,在三免后的2周内仍能维持较高水平。针对K88菌毛蛋白和E.coli C83903全菌的特异性Ig G和s Ig A抗体水平检测结果表明,在首免后的第7 d可在部分免疫组的肠黏液中检出特异性s Ig A,其中E.coli mLT-A72R组产生s Ig A的速度最快,抗体水平在第21 d便显著高于其他组并能持续保持较高水平;E.coli mLT-S63K组的K88特异性Ig G自第21 d一直处于较高水平,第42 d时仍显著高于其他组（p<0.05）。针对E.coli C83903全菌所产生的特异性抗体,在第35 d E.coli mLT-S63K组的Ig G水平显著高于其他实验组（p<0.05）,同时该组与E.coli mLT-R192G组肠黏液中的s Ig A水平显著高于其他实验组（p<0.05）,并能在第42d仍维持较高水平。免疫组化试验结果显示,免疫后第35 d,E.coli mLT-S63K组和E.coli mLT-R192G组小鼠Peyer’s淋巴结组织切片可见大量Ig A阳性细胞,数量明显多于其他组。小鼠脾淋巴细胞增殖实验和流式细胞术检测结果表明,IFN-γ和IL-4阳性脾淋巴细胞数显著高于对照组,IFN-γ/IL-4的比值小于1;血清IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子检测结果表明,口服活菌均可有效刺激小鼠产生Th1、Th2以及Th17型细胞免疫反应,血清中IL-4的表达水平更高。结合淋巴细胞亚群的检测结果表明口服突变菌株诱导的细胞免疫以Th2型细胞为主。抗体中和试验结果表明,免疫组血清和肠黏液中的Ig G和s Ig A具有中和LT活性,三组突变株的血清中和抗体效价均为1:89.1,肠黏液的中和抗体效价均为1:44.7,但分别高于E.coli C83903（35）est B组的1:53.7与1:26.9。综上所述,本研究构建的三株mLT突变株具有良好的遗传稳定性,基因编辑操作对其主要生物学特性无显著影响。突变株的生物学特性符合口服疫苗候选菌株基本条件,口服免疫小鼠后能诱导产生局部黏膜免疫、体液免疫以及细胞免疫应答。其中E.coli mLT-S63K株毒性最小、免疫效果最好,可作为ETEC口服疫苗候选菌株进行后续研究。本研究为仔猪大肠杆菌性腹泻的新型疫苗研究提供了实验数据和候选菌株。