背景与目的胃癌在全世界范围内癌症的死亡原因中排名第二位。作为一种最常发生的肿瘤,胃癌主要通过手术及联合的化疗等治疗方式来提高患者的生存率。然而,多种药物的耐药是导致胃癌患者预后不佳的主要原因。目前改良式或者新型的化疗是作为解决药物耐药以及改善胃癌患者预后的研究重点。类黄酮,主要从植物或者水果中提取,具有多种生物活性,被广泛的应用于肿瘤的治疗中。作为类黄酮的一种,从柑橘类水果中提取的柚皮素,在最近的研究中发现具有抗基因突变及抗肿瘤基因的作用。最新的研究表明,柚皮素能够在各种类型的癌细胞中,包括表皮样癌细胞,肝癌细胞,膀胱癌细胞,乳腺癌细胞,抑制癌细胞的生长,迁移,导致癌细胞生长周期的阻滞。然而,柚皮素在胃癌细胞中的抗癌活性目前未见报道。在各种肿瘤细胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2的过度表达,被普遍认为与药物的耐药性以及不佳的预后相关。ABT-737, BH-3的小型模仿蛋白,具有Bcl-2的抑制作用,其抗癌的功能在肺癌,急性粒细胞白血病,多发性骨髓瘤,淋巴瘤中被广泛研究。然而,ABT-737在胃癌细胞的作用也未必研究过。在本研究中,我们研究柚皮素和ABT-737在胃癌细胞中的联合应用的作用。结果显示,柚皮素或者ABT-737单独使用能够有效抑制癌细胞的生长及集落形成,而两种药物的联合使用进一步提高了其对胃癌细胞系细胞SGC7901的抑制能力。同时,由柚皮素和ABT-737介导的抑制作用与Akt和p53通路相关。资料与方法细胞培养和试剂人胃癌细胞系SGC7901被应用于本次实验中,在含有10%的小牛血清,1%的谷氨酰胺以及抗生素的RPMI-1640培养液中培养。细胞培养箱设定为37℃,CO2浓度为5%。柚皮素和ABT-737分别订购于美国Sigma公司和Selleck Chemicals。抗体多聚ADP核糖聚合酶(PARP), p-Akt以及Akt抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH), Caspase-3,p53抗体以及HRP链接的抗兔IgG抗体购自中国碧云天生物技术有限公司。细胞活性检测柚皮素或者ABT-737对SGC7901细胞生长的作用用细胞计数试剂盒检查(碧云天,中国)。首先,2000个细胞被培养在96孔板上,同时给予柚皮素或者ABT-737刺激48小时。之后给予细胞10μl WST-8溶液,继续培养2小时。细胞数量通过450nm波长的全自动定量绘图酶标仪测定。细胞的活性与对照组相比,并用直方图显示。所有细胞活性的检测总共重复了3次,每次进行3组实验。克隆形成实验500个SGC7901细胞被培养在6孔板上,用柚皮素或者ABT-737或者柚皮素联合ABT-737刺激6天。克隆细胞用甲醛在室温下固定15分钟,随后用结晶紫染色30分钟。数量超过50个细胞的克隆组被用来定量并用直方图显示。这项实验共重复了3次,每次进行3组实验。Western blots通过含有蛋白酶抑制剂符合剂的细胞裂解液裂解细胞,取得全细胞的裂解液。裂解液通过含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后将蛋白转染到PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶孵育PVDF膜。洗膜后用相应的一抗孵育,之后再次洗膜并用含HRP的二抗孵育。膜上的条带用ECL试剂(碧云天,中国)显影,并与暗室中摄像(Kodak, USA)。数据分析所有数据通过T检验以及单因素方差分析进行计算。标准差在直方图中显不。结果柚皮素以及ABT-737抑制SGC7901细胞的活性鉴于柚皮素和ABT-737具有抗癌的能力,我们通过细胞计数试剂盒检测他们对SGC7901细胞生长的作用。柚皮素明显抑制SGC7901细胞的生长,且呈剂量依赖关系。同时,ABT-737也能够抑制细胞活性并呈现出剂量依赖性。而柚皮素和ABT-737的联合应用则表现出对SGC7901细胞生长更加明显的抑制作用。这些结果意味着柚皮素不仅可以抑制胃癌细胞的生长,而且这种抑制效应能够被ABT-737所增强。柚皮素以及ABT-737抑制SGC7901细胞克隆形成实验由于之前的实验表明柚皮素以及ABT-737能够抑制细胞的生长,接下来我们通过克隆形成实验再次验证这种抑制能力。低密度的SGC7901细胞被种植在培养皿上,且用柚皮素以及ABT-737联合或者单独刺激6天。柚皮素或者ABT-737的单独刺激能够明显降低细胞的克隆数量,大约40%。而柚皮素和ABT-737的联合应用却能够降低约90%的克隆数量。因此,SGC7901细胞的克隆形成能够被柚皮素,ABT-737或者两者的联用所抑制。柚皮素以及ABT-737能够诱导caspase-3以及PARP的表达柚皮素和ABT-737能够在许多细胞中诱导凋亡的产生,因此我们在SGC7901细胞中验证了这种诱导凋亡的能力。凋亡相关蛋白caspase-3和PARP在SGC7901细胞中的表达通过Western blot来测定。柚皮素和ABT-737的单独刺激能够明显提高caspase-3的活性形式cleaved caspase-3的表达以及PARP的表达。而柚皮素以及ABT-737的联用则进一步增强的这种诱导作用,cleaved caspase-3以及PARP的表达被进一步提高,这也意味着柚皮素和ABT-737的联用增强了SGC7901细胞的凋亡。柚皮素和ABT-737增加p53的表达,降低Akt的活性柚皮素能够通过多种途径降低细胞的凋亡。而本此研究对柚皮素和ABT-737诱导细胞凋亡的通路也进行了研究。p53和Akt是细胞凋亡和存活的重要调解通路。我们的结果表明,柚皮素明显能够明显抑制Akt的磷酸化,而ABT-737却不具备这种作用。SGC7901细胞中磷酸Akt的表达被柚皮素或者ABT-737显著的降低。同时,柚皮素和ABT-737都能够提高p53蛋白的表达。这些结果意味着p53和Akt通路在柚皮素和ABT-737介导的SGC7901细胞凋亡的过程中起着重要的作用。结论1.柚皮素在胃癌细胞中具有抗癌的活性。2.ABT-737在胃癌细胞中具有抗癌的活性。3.柚皮素与ABT-737联合应用在胃癌细胞中的抗癌活性更强。4.柚皮素单独使用或者与ABT-737联合使用都能够诱导胃癌细胞生长与克隆形成的抑制。5.柚皮素和ABT-737能够诱导caspase-3以及PARP的活化,从而导致细胞的凋亡。6.Akt和p53通路参与柚皮素与ABT-737联合应用对胃癌细胞的抑制。