背景与目的　　 糖耐量受损(impaired glucose tolerance,IGT)是糖尿病前期(pr-diabetes)状态主要表现,是糖尿病病前的一种过渡状态,各种类型糖尿病的一个关键发展阶段。糖耐量受损能破坏体内糖代谢平衡,成为Ⅱ型糖尿病和增加心血管疾病风险的一个重要诱因。心肌功能降低是糖耐量受损阶段中发生的心血管损伤之一。同时长期炎症状态并伴随炎性细胞因子的异常表达,增加糖耐量受损发展阶段心血管并发症风险。糖尿病.心血管疾病.炎症之间的关系复杂,阐明其相互作用对于代谢性心肌功能损伤的防治具有重要的临床意义。　　 巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)作为一个重要的促炎因子,在心血管疾病和糖尿病等疾病患者相关组织中表达异常增加,而在代谢性心肌病(metabolic cardiomyopathy)发病机制中是否发挥调节作用有待深入研究。已知G蛋白偶联受体激酶-2(G protein coupled-receptor kinase 2,GRK2)是心肌病变的早期标记分子,c-jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路与细胞凋亡和慢性炎症相关。因此揭示MIF与GRK2、JNK之间的关系,能初步阐明糖尿病前期糖耐量受损状态心肌功能降低的病理生理学调节机制。　　 本研究在建立糖耐量受损大鼠模型的基础上,探讨糖耐量受损状态对大鼠的心肌功能、糖代谢、炎症因子以及凋亡相关信号通路的影响；同时以高浓度葡萄糖模拟糖耐量受损的餐后高血糖因素,建立高浓度葡萄糖条件心肌凋亡模型。通过体外细胞实验验证糖耐量受损的高血糖因素致心肌细胞凋亡作用,并探讨MIF是否参与此凋亡过程,以及MIF与GRK2、JNK之间的可能调控形式。　　 方法　　 利用低剂量链脲霉素(20 mg/kg)诱导建立糖耐量受损大鼠模型,0、2、4、6 wk进行大鼠空腹血糖测定和口服糖耐量试验,计算餐后血糖水平曲线下面积,评价大鼠的糖耐量水平；实验6wk,利用超声心动图测定各组大鼠左室射血分数和左室收缩分数等主要指标,反映心肌功能情况。6wk后,处死各组大鼠,制作心肌组织石蜡切片或提取心肌组织总蛋白。石蜡切片以糖原过碘酸雪夫碱PAS染色,光学显微镜观察心肌糖原或糖基化物质沉积情况；同时石蜡切片以末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色,光学显微镜观察分析糖耐量受损状态的致凋亡情况；以western blotting检测caspase-3分解活性片段、炎症因子MIF、心肌功能异常标记分子GRK2和磷酸化JNK在心肌组织的表达情况。　　 体外实验部分中,25mM D-葡萄糖作为高浓度糖实验诱导条件,模拟糖耐量受损状态的餐后高糖血症病理条件,建立心肌细胞凋亡模型,而5mM D-葡萄糖作为正常对照组或心肌细胞基础代谢的本底对照。以人源性成心肌细胞株AC16作为主要的实验研究对象。实验时以低糖DMEM培养基培养心肌细胞,然后正常组和实验组分别加入葡萄糖原液,使葡萄糖终浓度分别为5和25 mM。　　 通过荧光显微镜观察,以DCFH-DA荧光探针检测心肌细胞的胞内活性氧簇产生水平,评价高浓度葡萄糖的氧化应激压力作用,同时以JC-1荧光探针检测心肌细胞线粒体膜电位,评价高浓度葡萄糖的促凋亡作用,并以此作为高浓度葡萄糖氧化应激和致凋亡作用的定性分析。　　 为了模拟和验证糖耐量受损状态的餐后高糖血症对MIF、GRK2和JNK的直接调控作用,AC16细胞加入25 mM高浓度葡萄糖培养基培养20、30和60 min后,然后经蛋白裂解液裂解,提取总蛋白,通过western blotting检测MIF、GRK2蛋白表达和JNK磷酸化水平；同时25 mM高浓度葡萄糖培养基培养AC16细胞60 min时,以TRIZOL裂解细胞,提取总RNA,并以realtime-PCR检测MIF和GRK2 mRNA表达水平。　　 AC16细胞以JNK磷酸化抑制剂-SP600125(2.5 μM)、MIF互变异构酶活性拮抗剂-ISO-1(40 μM)或二甲亚砜(DMSO:0.1％)预处理1 h,然后以25mM高浓度葡萄糖条件培养72h,以明确MIF和JNK在高浓度葡萄糖诱导心肌细胞凋亡过程中的作用。细胞经胰酶消化后进行AnnexinV-FITC/PI双染色-流式细胞仪检测细胞荧光强度,数据通过处理,在二维图右下象限中计算细胞早期凋亡率；或经细胞蛋白裂解液裂解,提取总蛋白,以western blotting检测caspaSe-3活性分解片段。　　 以SP600125作为抑制JNK磷酸化活性的阳性对照,利用ISO-1抑制MIF互变异构酶活性,明确心肌细胞在高浓度葡萄糖条件下内源性MIF对JNK磷酸化活性的调控作用；AC16细胞以SP600125、ISO-1或二甲亚砜预处理1 h后,以25 mM高浓度葡萄糖条件培养30、60 min,然后以细胞全蛋白裂解液(含磷酸酶抑制剂)裂解细胞,以western blotting检测JNK磷酸化水平。同时利用ISO-1明确心肌细胞在高浓度葡萄糖条件下MIF互变异构酶活性对GRK2表达的调控作用,AC16细胞以ISO-1或二甲亚砜预处理1h后,以25 mM高浓度葡萄糖条件培养60 min,然后裂解细胞,提取总蛋白,western blotting检测GRK2表达。　　 结果　　 大鼠经链脲霉素注射后,在各时间点空腹血糖水平与正常组之间差异不显著。2、4、6 wk的口服糖耐量试验中,模型组大鼠开始出现糖耐量异常,其中血糖水平曲线下面积比正常对照组高,两组差异具有统计学意义。根据以往报道糖尿病前期状态糖耐量受损的血糖水平曲线下面积特征(比正常组高15-40％),在0、2、4、6 wk模型组大鼠血糖水平曲线下面积分别增加2.50％、16.28％、38.60％和38.61％,因此它们可以认为发生糖耐量受损。　　 另外模型组和正常组超声心动图指标左室射血分数和左室收缩分数分别为68.59±6.62％Vs 81.40±5.34％(t=4.020,p=0.002)、33.74±4.91％vs 44.60±5.11％(t=3.941,p=0.002),差异均有统计学意义,因此糖耐量受损的大鼠出现心肌功能降低。末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色和caspase-3western blotting检测,表明糖耐量受损状态的大鼠出现凋亡心肌细胞。同时糖原过碘酸雪夫碱PAS染色显示糖原或糖基化物质沉积在糖耐量受损大鼠的心肌组织,其中在血管周围组织的沉积明显。这些说明糖耐量受损具有一定的心脏糖毒性作用。另外,糖耐量受损大鼠的心肌组织中炎症因子-MIF和心肌病变标记分子-GRK2表达水平增加,JNK 通路激活。　　 体外实验部分中,DCFH-DA荧光探针显示心肌细胞在高浓度葡萄糖作用下,胞内活性氧簇在24h开始明显增强,表明高浓度葡萄糖具有强的氧化应激作用；同时JC-1探针荧光显示高浓度葡萄糖降低心肌细胞内线粒体膜电位,能触发心肌细胞凋亡。另外,高浓度葡萄糖促进AC16心肌细胞MIF、GRK2表达和JNK磷酸化水平增加。这与动物实验部分结果吻合,说明高浓度葡萄糖致心肌凋亡模型可以用于验证糖耐量受损高血糖因素的心脏糖毒性作用。高浓度葡萄糖同时促进MIF和GRK2 mRNA表达水平增加。　　 高浓度葡萄糖诱导AC16心肌细胞72 h凋亡率为11.536±1.442％,而经过SP600125或ISO-1预处理后,.AC16心肌细胞凋亡率分别下降至6.116±0.337％和5.776±1.217％(F=53.347,P<0.001),差异均具有统计学意义。高浓度葡萄糖作用72 h能激活AC16心肌细胞caspase 3,而经过SP600125或ISO-1预处理均使AC16心肌细胞caspase 3活化分解片段表达降低(F=20.169,P<0.001),差异均具有统计学意义。这表明高浓度葡萄糖可以通过MIF的互变异构酶活性和JNK磷酸化途径介导AC16心肌细胞凋亡。　　 结论　　 低剂量链脲霉素可建立糖耐量受损大鼠模型。糖耐量受损引起大鼠心肌功能降低和糖代谢异常,同时心肌组织存在炎症和凋亡细胞,表明糖耐量受损具有一定的心脏糖毒性作用。　　 高浓度葡萄糖诱导心肌细胞凋亡,能在一定程度说明糖耐量受损大鼠模型心肌功能降低的机制。活体实验中Caspase-3、MIF和磷酸化JNK的异常表达在体外心肌细胞实验得到验证,可能参与了心肌功能降低的病理过程,GRK2的表达能作为糖耐量受损心肌功能降低的监测指标。MIF的互变异构酶活性在高浓度葡萄糖诱导的心肌细胞凋亡、GRK2表达和JNK磷酸化中具有重要的调控作用。因此MIF可能是代谢性心肌病的一个关键调节因子,是炎症、糖尿病和心血管疾病之间的桥梁。　　 “高糖压力→MIF→JNK”通路可能参与了糖耐量受损诱发心功能降低的机制,因此这一新的调节通路可能在代谢性心肌病的发病过程中具有重要的作用。在氧化应激、炎症、心肌细胞凋亡过程的分子机制中,对这一信号通路深入研究,可为探索糖尿病心血管病并发症的潜在治疗靶点开辟新的途径。