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研究目的:通过实验明确氯硝柳胺乙醇胺与盐酸埃克替尼联合应用在体外对人肺腺癌HCC827细胞的增殖抑制、促进凋亡、抑制克隆及侵袭力的作用,探索两药合用是否具有协同抗肿瘤效应,为非小细胞肺癌选择联合用药的治疗方案提供理论依据。研究方法:1.配制盐酸埃克替尼储备液,采用梯度稀释法配置不同浓度的盐酸埃克替尼,以未加药的HCC827细胞作为对照组,用CCK-8法检测细胞活性,计算盐酸埃克替尼各给药组的细胞活力,确定盐酸埃克替尼的半数抑制浓度。2.配制氯硝柳胺乙醇胺母液,采用梯度稀释法配制不同浓度的氯硝柳胺乙醇胺溶液,以未加药的HCC827细胞作为对照组,用CCK-8法检测细胞活性,计算氯硝柳胺乙醇胺各给药组的细胞活力,计算氯硝柳胺乙醇胺的半数抑制浓度,为氯硝柳胺乙醇胺的联用浓度提供参考。3.根据已确定的氯硝柳胺乙醇胺的IC50固定三个浓度:0.1、0.5和1.0μM,增加盐酸埃克替尼的浓度,考察HCC827细胞增殖受到的抑制情况。绘制盐酸埃克替尼浓度从0.01μM到25μM时,两药联合对HCC827细胞增殖的抑制曲线,与单用盐酸埃克替尼时细胞的增殖抑制水平对比。4.检测两药是否有协同效应:设置不同的组别:(1)对照组,(2)盐酸埃克替尼0.1μM组,(3)盐酸埃克替尼0.5μM组,(4)氯硝柳胺乙醇胺0.25μM,(5)氯硝柳胺乙醇胺0.25μM+盐酸埃克替尼0.1μM,(6)氯硝柳胺乙醇胺0.25μM+盐酸埃克替尼0.5μM。5.检测方法:(1)AnnexinV-FITC/PI双染法联合流式细胞术检测细胞的凋亡。(2)克隆形成实验计算克隆形成率。(3)计数Transwell小室中细胞的迁移数量。结果:1.盐酸埃克替尼在48小时的作用情况下,对HCC827细胞的IC50为0.61μM。随着盐酸埃克替尼的浓度的增加,细胞增殖受到的抑制效应逐渐增强。2.氯硝柳胺乙醇胺对HCC827细胞的增殖抑制存在剂量依赖的相关性,在浓度达到2.5μM之后,细胞增殖抑制达到饱和状态。经计算,氯硝柳胺乙醇胺在48小时的作用情况下,对HCC827细胞的IC50为0.46μM。两药联用时,氯硝柳胺乙醇胺1.0μM的处理组对细胞的抑制作用最明显,在极低浓度下细胞的生长即可被明显抑制。3.盐酸埃克替尼单药处理HCC827细胞,HCC827细胞的凋亡与盐酸埃克替尼存在剂量相关性。氯硝柳胺乙醇胺单药处理HCC827细胞,也可以促进HCC827的细胞凋亡。联合应用组与单独应用组相比,HCC827细胞的晚期凋亡和坏死的比例都有所增加,而细胞早期凋亡的比例没有明显变化。4.未予以药物处理的HCC827细胞形成了明显的细胞克隆,经过盐酸埃克替尼或氯硝柳胺乙醇胺处理后,HCC827细胞的克隆减少明显。氯硝柳胺乙醇胺与盐酸埃克替尼联合处理组,HCC827细胞几乎不能形成克隆。不同浓度的药物作用于HCC827细胞72 h后,与对照组相比,药物作用后能明显降低HCC827细胞的侵袭性,且盐酸埃克替尼与氯硝柳胺乙醇胺联合组的细胞数少于盐酸埃克替尼单药组、氯硝柳胺乙醇胺单药组。结论:1.盐酸埃克替尼抑制人肺癌HCC827细胞株的增殖,其抑制效应具有浓度依赖性。2.氯硝柳胺乙醇胺对人肺癌HCC827细胞株的增殖具有抑制作用,其抑制效应具有浓度依赖性。3.氯硝柳胺乙醇胺联合盐酸埃克替尼对人肺癌HCC827细胞有协同促进凋亡、抑制细胞克隆形成、减弱细胞侵袭力的作用。