高温降解纤维素菌株的筛选及酶学性质的研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:renminjie
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纤维素是世界存在最广泛的可再生资源,利用微生物生产的纤维素酶可以将其降解转化成可直接利用的小分子物质。对解决环境污染、农作物资源浪费等问题具有重大意义。本文主要针对高温降解纤维素菌株的筛选、产酶条件的优化、单一组分纤维素酶的分离纯化及蛋白酶酶学性质的研究等方面进行探索。结果如下:(1)于三种堆肥中分离出12株纤维素降解菌株,经过初筛和复筛结合对比,获得一株能够高效降解纤维素的嗜热菌株A7。对菌株进行形态学鉴定并构建系统发育树,确定该菌株为放线菌的链霉菌属(Streptomyces sp)。(2)对菌株A7液态发酵的培养基成分及发酵条件进行优化研究,实验结果为:最佳碳源为花生秸秆,碳源添加量为4%;最佳无机氮源为硝酸钾,有机氮源为花生粉饼,两者添加比例为4:1,总氮源添加量为0.8%;Ca Cl2最适添加量为0.075%;最适接种量(1×108个/m L)为4%;最适初始p H为4;在温度为50℃条件下培养96 h后,菌株A7的产酶量达到最大,β-葡糖苷酶(β-Gase)酶活达到165.07 U/m L,羧甲基纤维素酶(CMCase)酶活达到156 U/m L,滤纸酶活(FPase)达到150 U/m L。(3)固体发酵单因素优化实验、中心组合实验和响应面分析结果表明,培养温度、发酵时间、C/N、接种量是影响菌株A7产酶的显著因素。对其进行响应面分析后,培养基成分及发酵条件更加优化,最终使CMCase的产酶量提高到110.76 U/m L,是单因素优化后的1.18倍,β-Gase的产酶量提高到114.76 U/m L,是单因素优化后的1.2倍。(4)将菌株液体发酵获得的粗酶液依次经过硫酸铵沉淀、超滤浓缩、Sephadex G-75层析后得到一组纯的内切葡聚糖酶。SDS-PAGE显示为单一条带,分子质量约为23 k Da。对获得的纯蛋白酶进行酶学性质分析,确定其最佳反应p H为5,在p H为3-6之间的偏酸性环境中有较高的稳定性。酶促反应最佳温度是50℃,在40-60℃间有很好的热稳定性。低浓度的K+、Ca2+、Na+在酶促反应中对酶活性有促进作用,低浓度的Ba2+、Co2+、Mn2+对酶活性有抑制作用。Na N3、DTT、EDTA对酶促反应均有抑制作用。底物专一性的研究结果表明,该蛋白酶具有较高的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性。酶促反应中,其米氏常数Km值为0.4 mg/m L,最大反应速度为1.87 min.m L/mg。
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