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世界卫生组织国际癌症研究机构2020年最新统计,乳腺癌已经超过肺癌,成为全球最常见的癌症,跃居全球女性癌症发病率和死亡率第一位,对乳腺癌发病机制的深入研究已成为乳腺癌研究的热点。第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten,PTEN）是重要的抑癌蛋白,是人类癌症最常发生的突变基因之一,通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide3-kinase,PI3K）/Akt致癌信号通路,从而发挥抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用。乳腺癌患者中极少见到PTEN的基因突变,但可以观察到癌组织中PTEN蛋白水平降低,提示PTEN表达异常参与乳腺癌的发病。因此,深入研究PTEN在乳腺癌发生发展中的作用及其调控机制,对于探索乳腺癌的潜在药物靶点和治疗方案具有重要的意义。我们合作者的实验室近期研究发现,PTEN是神经前体细胞表达的发育下调蛋白 8（developmental down-regulation protein 8,Nedd8）的一个新靶点。Nedd8 介导PTEN发生类泛素化修饰,导致PI3K/Akt通路过度激活,从而促进肿瘤细胞增殖,与乳腺癌患者的分期和预后不良密切相关。通过一系列条件的筛选,发现高浓度葡萄糖可以诱导PTEN发生类泛素化修饰,导致细胞质中的PTEN入核,促进乳腺癌细胞的增殖和肿瘤的发生发展。但是,乳腺癌中高浓度葡萄糖导致PTEN发生类泛素化修饰的分子机制尚不明确。类泛素化系统包括一种E1激活酶（由UBA3和NAE1/APP-BP1构成的异源二聚体）,两种E2结合酶（UBE2M/Ubc12和UBE2F）以及多种E3连接酶。其中,UBA3作为E1激活酶的组成部分,参与PTEN类泛素化修饰的发生。但是,UBA3是否参与高糖诱导的PTEN类泛素化修饰,进而参与调控乳腺癌的发生发展,目前尚是这一研究领域的空白。为了研究高糖状态下PTEN发生类泛素化修饰的分子机制及其在乳腺癌中的作用,本实验选用人乳腺癌细胞系MCF-7和PTEN缺失的人乳腺癌细胞系BT-549,应用免疫共沉淀技术、western blot技术、qPCR技术、CRISPR-Cas9技术、免疫荧光技术等,结合CpG-island、UCSC等数据库分析,首先观察了高浓度葡萄糖对UBA3表达以及PTEN类泛素化修饰的影响,特异性敲除UBA3后对PTEN亚细胞定位的影响。然后,应用类泛素化激活酶E1的小分子抑制剂MNL4924,研究MCF-7细胞中PTEN类泛素化修饰及其PI3K/Akt信号通路的变化,观察肿瘤细胞行为学的改变,包括细胞迁移、增殖及克隆形成。实验结果如下:1.在MCF-7细胞中给予25 mM葡萄糖处理24hrs,UBA3蛋白表达水平显著上调,PTEN（K402）类泛素化水平升高,pT308 Akt和pS473 Akt磷酸化水平也升高,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。给予1μMMLN4924处理可显著抑制PTEN（K402）类泛素化水平,pT308 Akt和pS473 Akt磷酸化水平也降低,差别具有统计学意义（P<0.05）。2.在MCF-7细胞中给予5 mM 2-DG处理24 hrs,UBA3的mRNA水平和蛋白表达水平均降低,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光染色结果显示,2-DG处理不影响UBA3的细胞定位,大部分位于细胞质中,少部分位于细胞核中。3.在MCF-7细胞中,应用CRISPR-Cas9技术敲除UBA3,细胞UBA3的蛋白不表达,在细胞核中也观察不到PTEN的表达,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。4.应用CpG-island数据库和UCSC数据库序列分析显示,UBA3启动子区存在一个 CpG-island。应用 Human Protein Atlas、GEO 和 TCGA 数据库分析显示,UBA3启动子甲基化水平在乳腺癌病例中下调,UBA3蛋白表达水平在乳腺癌病例中显著上调。应用MethHC数据库进行UBA3甲基化水平和mRNA表达水平之间的相关性检测,线性回归分析表明,UBA3的mRNA水平和启动子甲基化水平之间存在显著的负相关。5.在 BT-549 和 MCF-7 细胞中,分别给予 0μM,0.5 μM,1.0μM,1.5 μM 浓度的MLN4924处理12 hrs,结果显示,MCF-7细胞中PTEN类泛素化水平降低,pT308 Akt和pS473 Akt磷酸化水平均降低,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。BT-549细胞中pT308 Akt和pS473 Akt磷酸化水平不变。6.在 MCF-7 细胞中给予 0μM,0.02μM,0.05 μM,0.1μM 浓度的 MLN4924 处理12天,细胞克隆形成数量随着MLN4924浓度梯度升高而减少,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。给予0μM,0.5 μM,1.0 μM,1.5 μM浓度的MLN4924处理12hrs,细胞迁移能力随着MLN4924浓度梯度升高而下降,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。7.在BT-549细胞中给予0.025 μM MLN4924处理5天,细胞增殖能力无明显改变。给予 0 μM,0.02 μM,0.05 μM,0.1 μM 浓度的 MLN4924 处理 12 天,细胞克隆形成数量无明显变化。给予0μM,0.5 μM,1.0μM,1.5 μM浓度的MLN4924处理12 hrs,细胞迁移能力并不随着MLN4924的浓度升高而变化。综上所述,高浓度葡萄糖可以通过上调MCF-7细胞中UBA3的蛋白和mRNA水平,导致PTEN发生类泛素化修饰,通过激活PI3K/Akt通路,促进乳腺癌细胞增殖和迁移。MLN4924以PTEN依赖的方式抑制PI3K/Akt通路,发挥抗肿瘤作用。由于MLN4924已在一系列抗肿瘤治疗的Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期临床试验中进行了评估,具有良好的安全性和耐受性,在肿瘤等多种疾病的治疗中既可单独使用,也可与化疗/放疗联合应用。因此,本研究为调控PTEN类泛素化修饰作为乳腺癌治疗的潜在靶点提供了可靠的实验依据,同时也为MLN4924作为乳腺癌的潜在治疗药物提供思路。