【摘 要】
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目的:人类巨细胞病毒（HCMV）为嗜神经病毒,病毒一旦感染人体,则会终身潜伏在神经系统。近年来的研究显示,潜伏感染的HCMV会通过调节宿主细胞micro RNA（miRNA）从而影响神经系统肿瘤的发生发展。有报道显示miR-409-3p在结肠癌、膀胱癌、骨肉瘤等疾病中发挥着重要的调节作用,而miR-409-3p是否在HCMV感染后的神经胶质瘤中发挥调节作用,目前还尚不明确。ZEB1是一个转录因子,
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目的:人类巨细胞病毒（HCMV）为嗜神经病毒,病毒一旦感染人体,则会终身潜伏在神经系统。近年来的研究显示,潜伏感染的HCMV会通过调节宿主细胞micro RNA（miRNA）从而影响神经系统肿瘤的发生发展。有报道显示miR-409-3p在结肠癌、膀胱癌、骨肉瘤等疾病中发挥着重要的调节作用,而miR-409-3p是否在HCMV感染后的神经胶质瘤中发挥调节作用,目前还尚不明确。ZEB1是一个转录因子,ZEB1在调节癌细胞的存活、分化、增殖、衰老和凋亡等中起着至关重要的作用并与肿瘤细胞迁移、侵袭、转移能力密切相关,目前,关于ZEB1在神经胶质瘤中的机制研究较少。本研究将重点讨论HCMV感染对神经胶质瘤细胞micro RNA-409-3p/ZEB1的影响,探究病毒感染调控神经胶质瘤细胞迁移的分子机制。方法:本研究首先分析HCMV感染后的转录组测序结果,探讨miR-409-3p在感染前后表达水平的差异,接着,在感染HCMV后的神经胶质瘤细胞系U251、T98、U87细胞中验证miR-409-3p表达,同时利用Targetscan进行miR-409-3p靶基因生物信息学预测,筛选出锌指结合蛋白1（ZEB1）为miR-409-3p潜在下游靶基因。接下来通过构建与miR-409-3p存在潜在的结合位点的ZEB13’-UTR的野生型（Wt）与突变型（Mut）双荧光素酶报告基因载体,进行靶基因结合位点验证。用miR-409-3p mimics及miR-409-3p-NC,sh ZEB1分别转染HCMV感染后的U87细胞,实时定量RT-PCR（q RT-PCR）检测ZEB1基因表达水平变化,蛋白质免疫印迹（Western-Blot）检测ZEB1蛋白表达水平变,U87细胞的迁移能力变化情况则通过比较细胞划痕实验中伤口愈合速度以及Transwell细胞迁移实验中细胞迁移数量进行测定。结果:转录组测序数据结果显示,miR-409-3p表达量在HCMV感染的U87细胞中显著下调（P<0.05）,定量RT-PCR（q RT-PCR）结果显示在HCMV感染后的U87,U251,T98胶质瘤细胞系中miR-409-3p下调（P<0.05）,而ZEB1显著上调（P<0.05）。生物信息学预测显示,miR-409-3p可以直接靶向ZEB1 3’-UTR。在转染野生型ZEB1 3’-UTR与miR-409-3p的细胞中荧光素酶活性显著低于3’-UTR结合位点突变型（P<0.01）,证实miR-409-3p能够与ZEB1 3’-UTR结合。划痕实验和Transwell迁移实验结果均显示,miR-409-3p的过表达能够抑制U87细胞迁移能力（P<0.05）,而ZEB1回复表达可一定程度恢复U87细胞迁移能力（P<0.05）,q RT-PCR与Western-Blot实验结果均证明在miR-409-3p过表达组中ZEB1的表达量在U87细胞中降低（P<0.05）,而ZEB1回复组中的ZEB1表达得到恢复。证实了miR-409-3p通过ZEB1调控胶质瘤细胞的迁移。结论:本研究证明了miR-409-3p与ZEB1基因的靶向关系,在HCMV感染后的U87细胞中HCMV诱导miR-409-3p下调进而导致ZEB1上调,增强了U87细胞的迁移能力,表明HCMV感染引起的miR-409-3p表达变化,在神经胶质瘤的病程中起着重要的调节作用。
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