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酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides,简称CPP)的结构特性,决定了其种类的多样性。不同的公司使用的酶以及酶解条件不同,最终获得的CPP序列会存在一定差别,目前尚无统一的定性定量方法评价及检测CPP。为了解决这个问题,对酪蛋白进行了酶解,对其酶解产物进行了定性分析,并分离出持钙活性肽,对其中的主要成分进行了分离及序列鉴定,筛选了含CPP样品的前处理方式,同时建立了CPP的高效液相色谱检测方法,并进行了应用。主要研究内容及结果如下:(1)从酪蛋白酶解物中筛选出了CPP,分离出了5个单体组分,并鉴定了活性单体的结构序列,其中磷酸丝氨酸个数最多的单体序列为:RELEELNVPGEIVESLSS SEESITR。(2)从不同样品前处理方式中选择了相对合适的液态奶、奶粉及钙片样品的前处理方式:牛奶采用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid,简称TCA)法结合热变性法、酸奶采用先稀释调节pH再用TCA法、奶粉采用等电点法、钙片采用溶解超声提取法,检测结果显示分析效果较好。(3)优选了色谱柱、流动相、柱温及流速等HPLC分析条件,筛选出的分析CPP条件为:色谱柱采用月旭的C18柱、流动相为乙腈添加1‰三氟乙酸(Trifluoroacetic Acid,简称TFA)和水添加1‰TFA、柱温35℃、二元高压梯度洗脱模式、总流速0.8 mL/min、紫外检测波长215 nm。(4)建立了奶粉中CPP的HPLC定量检测方法,其梯度洗脱条件为:10%~20%乙腈(1‰TFA)洗脱15 min,20%~26%乙腈(1‰TFA)洗脱30 min,进样量20μL。该方法的检测限为15.34 mg/kg,定量限为51.14 mg/kg。在此条件下,CPP能够与杂质等干扰成分达到较好的分离效果,检测到奶粉样品中CPP的加标回收率在97.59%~100.00%之间,接近真实添加量。同时测定了不同厂家的奶粉样品,检测结果与厂家标称含量接近,该方法适用性良好。(5)建立了牛奶中CPP的HPLC定量检测方法,其梯度洗脱条件为:5%~35%乙腈(1‰TFA)洗脱45 min,进样量20μL。该方法的检测限为6.00 mg/kg,定量限为20.00 mg/kg。在此条件下,CPP能够与杂质等干扰成分达到较好的分离效果,检测到牛奶样品中CPP的加标回收率在89.36%~94.94%之间,接近真实添加量。(6)建立了酸奶中CPP的HPLC定量检测方法,其梯度洗脱条件为:10%~20%乙腈(1‰TFA)洗脱15 min,20%~26%乙腈(1‰TFA)洗脱30 min,进样量20μL。该方法的检测限为3.07 mg/kg,定量限为10.23 mg/kg。在此条件下,CPP能够与杂质等干扰成分达到较好的分离效果,检测到酸奶样品中CPP的加标回收率在97.73%~102.28%之间,接近真实添加量。(7)建立了钙片中CPP的HPLC定量检测方法,其梯度洗脱条件为:5%~35%乙腈(1‰TFA)洗脱45 min,进样量20μL。该方法的检测限为13.62 mg/kg,定量限为45.40 mg/kg。在此条件下,CPP能够与杂质等干扰成分达到较好的分离效果,检测到钙片样品中CPP的加标回收率在95.51%~102.26%之间,接近真实添加量。同时测定了不同钙片样品,检测结果与厂家标称含量接近,该方法适用性良好。建立了CPP快速钙盐直观评价法演示试验,结合原子吸收光谱仪检测钙含量,确认了快速钙盐直观评价法演示试验的可靠性,并依据结果可知,添加了CPP的钙片,钙离子保持溶解的时间更长。