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肺癌是世界上死亡率最高的肿瘤之一。治疗肺癌的主要方法有手术治疗、化疗和放疗,其中,放疗是治疗肺癌的重要手段,然而,放疗会激活大量与辐射抵抗相关的基因,从而严重影响放疗疗效。如何提高肿瘤细胞对放疗的敏感性,更加有效的治疗肺癌,是目前放射治疗面临的重大问题。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的小RNA,大约有22个核苷酸的长度,miRNAs能够通过翻译抑制或与其靶基因mRNA的3’UTR互补结合降解mRNA,调控基因的表达。最近研究发现,miRNAs在肿瘤细胞的辐射敏感性中起着关键性的作用。miR-320a属于miR-320家族,在不同肿瘤中发挥着抑癌或致癌的作用。本研究旨在探讨miR-320a在肺腺癌以及辐射抵抗的肺腺癌细胞中的作用,并进一步研究其相关机制,为提高放疗效果提供科学依据。一、miR-320a对肺腺癌细胞生长及辐射敏感性影响的研究(一)miR-320a在肺腺癌组织中表达量的检测收集18例肺腺癌及相应癌旁组织,qRT-PCR检测组织中miR-320a的表达情况,结果发现癌组织中miR-320a表达量低于癌旁组织。(二)miR-320a对LTEP-a-2细胞增殖的影响及与辐射敏感性的关系LTEP-a-2细胞分别转染miR-320a、mu-320a、NC,MTT、流式细胞术检测miR-320a对LTEP-a-2细胞增殖、凋亡的影响。结果发现,miR-320a能够抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。LTEP-a-2细胞分别转染miR-320a、mu-320a、NC,用X射线照射处理后,MTT、流式细胞术检测miR-320a对细胞辐射敏感性的影响。结果显示,miR-320a能够增强LTEP-a-2细胞对X射线的辐射敏感性。建立辐射抵抗肺腺癌细胞株A549/34R,转染miR-320a,然后进行X射线照射处理,采用MTT、流式细胞术检测miR-320a对辐射抵抗A549/34R细胞增殖、凋亡与辐射敏感性的影响。结果显示,miR-320a能抑制A549/34R细胞的增殖,促进细胞的凋亡并增强细胞的辐射敏感性。二、miR-320a通过STAT3信号通路对肺腺癌细胞增殖的研究(一)pcDNA-GFP-stat3-3’UTR 载体构建通过miRNA靶基因预测软件分析,发现STAT3基因的3’非UTR存在miR-320a的调控位点;PCR特异性扩增STAT3基因3’UTR序列,将其克隆到pcDNA-GFP 载体中,成功构建 pcDNA-GFP-stat3-3 ’UTR 载体。(二)miR-320a对基因stat3及下游基因的调控作用将pcDNA-GFP-stat3-3’UTR载体与miR-320a共转染肺腺癌细胞中,荧光显微镜与流式细胞仪检测GFP表达量。结果显示,miR-320a可使细胞内GFP表达量显著降低,表明miR-320a能负调控stat3基因的表达。Western blot和免疫荧光实验进一步证明,miR-320a能够降低STAT3和p-STAT3的表达量。进一步研究发现,发现miR-320a能降低STAT3下游蛋白Bcl-2表达。(三)干扰STAT3表达对肺腺癌细胞生长的影响设计针对STAT3的siRNA并转染细胞,采用MTT、Annexin V-FITC/PI双染的方法检测siRNA对LTEP-a-2细胞和辐射抵抗A549-34R细胞增殖和凋亡的影响。结果显示,敲低STAT3后能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,,经X射线照射后,这一作用更加明显。(四)MiR-320a抑制辐射抵抗肺腺癌细胞增殖的体内实验将转染 miR-320a、STAT3-siRNA 的 A549/R34 细胞,注射到 BALB/c-nu/nu裸鼠皮下,每隔三天测量一次肿瘤大小,并记录。4周之后,将皮下移植瘤取出,称重,并检测相关蛋白的表达。结果发现,转染miR-320a、STAT3-siRNA的肿瘤体积、重量均明显小于对照组肿瘤。取出的肿瘤组织提取总蛋白,western blot实验结果显示,转染miR-320a、STAT3-siRNA的肿瘤组织中STAT3、p-STAT3表达量明显下降,而裂解片段caspase3表达量明显增高。三、miR-320a对肺腺癌细胞迁移能力的影响(一)miR-320a对肺腺癌细胞迁移及辐射敏感性的影响转染miR-320a、STAT3-siRNA的A549/34R细胞,培养48h后,做细胞迁移实验,实验结果显示,转染miR-320a、STAT3-siRNA后,细胞迁移数明显少于对照组。研究还发现,转染miR-320a、STAT3-siRNA后,可以增强A549/34R细胞的辐射敏感性。(二)miR-320a对肺腺癌细胞裸鼠转移瘤的影响为了明确miR-320a在体内对肺腺癌细胞转移瘤成瘤能力的影响,通过裸鼠的尾静脉注射注射转染miR-320a、STAT3-siRNA的A549/34R细胞并饲养7周后,取出裸鼠体内的肺脏,观察肺表面的转移灶,并做HE染色和免疫组化。结果显示,转染miR-320a、STAT3-siRNA后,转移灶明显少于对照组,细胞粘附分子CD44在转染miR-320a、STAT3-siRNA组中也显著降低。(三)在肺腺癌样本中STAT3高表达收集18例肺腺癌及相应癌旁组织,qRT-PCR检测组织中STAT3的表达情况,结果发现癌组织中STAT3表达量高于癌旁组织。与miR-320a表达量正好相反。从数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query)下载 STAT3 表达数据,用Kaplan-Meier曲线代表生存曲线。结果显示,STAT3高表达与病人较差的预后有关。结论1.miR-320a能够抑制肺腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,并且能够增强肺腺癌细胞对X射线辐射的敏感性。2.miR-320a通过调控STAT3及下游分子抑制肺腺癌细胞增殖,并增强肺腺癌细胞对辐射的敏感性。3.miR-320a可抑制肺腺癌细胞迁移能力及裸鼠转移瘤的成瘤能力。