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研究背景:恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的常见病。目前,临床上恶性肿瘤的治疗主要采用手术、化疗、放疗等综合治疗手段,其中,化疗成为各种晚期恶性肿瘤有效治疗的基础。顺铂(Cisplatin,DDP)是临床常用的细胞周期非特异性化疗药物,主要用于肺癌、睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈部肿瘤等实质性恶性肿瘤的一线治疗。临床研究发现,DDP抗肿瘤作用的疗效与其用药剂量呈正相关,然而,DDP在杀伤肿瘤细胞的同时也会对机体产生剂量依赖性的毒副作用,如消化道反应、肝肾损害等。其中,在接受大剂量DDP治疗的肿瘤病人中,60～80%的患者可发生急性肾功能衰竭,极大地限制了其临床应用。目前研究证实,DDP所致的肾毒性损伤主要发生在肾小管细胞,其发生主要与氧化应激机制有关,但至今为止DDP肾毒性损伤的作用机制尚不清楚,并且临床上也无可靠的、特异性的治疗方法。近年研究发现,炎症及肾血液动力学变化可能在DDP所致急性肾损伤中发挥重要作用。本课题在前期研究基础上,深入研究DDP肾毒性损伤的作用机制,为临床DDP肾毒性损伤的防治奠定理论和实验基础。目的:利用大剂量DDP急性肾功能衰竭的动物模型,探讨大剂量DDP肾毒性损伤早期特别是肾小球的变化及其发生机制,进一步了解全反式维甲酸(ATRA)对大剂量DDP所致小鼠急性肾功能衰竭的保护作用,为DDP毒副作用的防治提供理论及实验依据。方法:首先,取C57/BL6小鼠,雌雄各半,依体重随机分为DDP用药组和生理盐水(NS)对照组,5～45mg/kg的DDP单次腹腔注射,等量生理盐水对照。观察并记录各组小鼠用药后的毒副作用及存活情况,选择可使多数小鼠死亡时所用DDP的最小使用剂量作为本研究使用DDP制备小鼠急性肾功能衰竭所用DDP的剂量。然后,再取C57/BL6小鼠,依性别、体重随机分组:DDP用药组、DDP+ATRA干预组(ATRA用药组)和生理盐水(NS)对照组,并与CXC受体拮抗剂G31P(G31P用药组)和NF-kB抑制剂PDTC(PDTC用药组)干预比较。选用可使多数小鼠死亡所用的DDP使用剂量(15 mg/kg)单次腹腔内注射,20mg/kg的ATRA于DDP用药前0.5h单次腹腔内注射,500μg/kg G31P每日皮下注射一次,连用3d,50mg/kgPDTC每日皮下注射一次,连用3d,等量生理盐水对照。每组分别取10只小鼠,观察并记录所有小鼠用药后的反应、体重变化及存活时间,其中,每组取5只小鼠分别放于代谢笼内,DDP用药后6、24、48、72h分别收集尿液,尿蛋白定量及定性检测。随后,分别取对照组小鼠和DDP用药后6、24、48、72h的DDP用药组、ATRA用药组小鼠各10只,称重后乙醚麻醉或0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,心脏穿刺取血检查血尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、尿酸(UA)含量;分别留取肾组织,并制备10%肾匀浆检测髓过氧化物(MPO)、丙二醛(MDA)含量。同时,取少量肾组织,Western Blot检测各组小鼠肾皮质组织血管内皮细胞中CD31表达的变化;戊二醛固定,电镜检测;10%福尔马林固定,免疫组化检测Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)和纤维连接蛋白(FN-1)表达,显微镜观察、照相。结果:与对照组小鼠比较,不同剂量DDP腹腔注射后,小鼠出现小鼠嗜睡拥挤在一起,活动、进食等减少,体重下降等,并随DDP用药剂量的增加小鼠存活时间减少、生存率下降,其中,45mg/kg DDP用药后1天内死亡,15mg/kg DDP用药后1周内60%小鼠死亡,而10mg/kg DDP用药后1周小鼠全部存活。因此,我们选用15mg/kg作为本实验诱导小鼠急性肾功能衰竭所用DDP的使用剂量。进一步研究发现,15mg/kg DDP单次腹腔内注射后48h,用药小鼠血Bun、Cre含量较对照组小鼠显著增高,证实15mg/kgDDP可引起小鼠急性肾功能衰竭。HE检测发现,DDP用药48h内肾小管无明显形态学改变,但肾小球内细胞数较对照组明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05);DDP用药48h后,肾小管出现明显的形态学改变。因此,本研究主要探索大剂量DDP用药48h内对肾小球的作用及ATRA干预的作用机制。电镜、Western Blot检测、免疫组化检测及生化检测等实验发现:大剂量DDP不但可引起肾小球血管内皮细胞的损伤、激活中性粒细胞,同时也可以引起肾小球基底膜及足细胞的损伤,产生大分子量的蛋白尿。20mg/kg的ATRA可明显增加DDP用药后小鼠的尿量,减轻DDP用药后出现的毒性反应,有效延长DDP用药后小鼠的生存时间,使DDP用药后lw的生存率提高至90%。HE染色检测肾小球内每高倍视野细胞数较DDP用药组减少,而与对照组无显著性差异。电镜检测证实,ATRA用药后小鼠肾小球内皮细胞凋亡减少、基底膜及足细胞损伤减轻,并且中性粒细胞的释放量减少。Western Blot检测发现,ATRA用药后小鼠肾皮质CD31的表达较DDP用药组小鼠明显增多,但仍略低于正常对照组小鼠。免疫组化检测发现,ATRA用药后小鼠COL-Ⅳ、FN-1的表达较DDP用药组小鼠明显减少,但仍多于正常对照组小鼠。生化检测发现,ATRA用药后小鼠血清中UA、XOD含量显著低于DDP用药组小鼠,而与对照组小鼠比较差异无统计学意义(p>0.05);ATRA用药后肾皮质MPO、MDA含量较DDP用药组小鼠显著降低,而与对照组小鼠比较差异无统计学意义(p>0.05)。此外,ATRA用药后小鼠尿蛋白排出量特别是大分子量蛋白尿的排出量显著低于DDP用药组,但仍高于正常对照组小鼠。DDP用药后,DDP用药组小鼠肾组织中的TNF-α mRNA含量别明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。DDP用药后6h,DDP用药组小鼠肾组织中的IFN-γ mRNA含量与对照组IFN-γ mRNA含量差异不具有统计学意义(p>0.05);ATRA用药组于DDP用药后24h内,IFN-γ mRNA含量与DDP用药组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.15mg/kg DDP用药1w后可使60%的C57/BL6小鼠死亡。DDP用药后48h,小鼠血BUN和CRE明显增高,提示小鼠出现急性肾功能衰竭。形态学研究发现:DDP用药48h内,肾小球无明显形态学改变,但肾小球内细胞数明显增多,而肾小管上皮细胞内仅见线粒体水肿,亦无明显形态学改变;DDP用药后72h肾小管上皮细胞出现损伤性改变。2.ATRA干预后可明显减轻DDP用药后的毒副作用,改善肾脏功能,延长DDP用药后1w小鼠生存期。ATRA可显著降低DDP所致的肾小球滤过膜的损伤、减少中性粒细胞的激活,并且减少DDP用药后小鼠蛋白尿的排出。提示ATRA可能通过抑制中性粒细胞激活、减少炎性介质的释放从而拮抗大剂量DDP所致的急性肾损伤。