【摘 要】
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本实验利用含有完整奶牛αs1-酪蛋白(CSN1S1)和p-酪蛋白基因(CSN2)的BAC克隆RP42-254I13，通过单侧寡核苷酸嵌套PCR(single oligonucleotide nestedPCR，SON-PCR)技术分别来获得牛αs1-和β-酪蛋白基因的上游20kb和14kb的侧翼序列，并以此作为模板扩增同源臂，借助Red重组系统通过空隙修复(Gap-repair)的方式从BAC克隆
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本实验利用含有完整奶牛αs1-酪蛋白(CSN1S1)和p-酪蛋白基因(CSN2)的BAC克隆RP42-254I13，通过单侧寡核苷酸嵌套PCR(single oligonucleotide nestedPCR，SON-PCR)技术分别来获得牛αs1-和β-酪蛋白基因的上游20kb和14kb的侧翼序列，并以此作为模板扩增同源臂，借助Red重组系统通过空隙修复(Gap-repair)的方式从BAC克隆RP42-254I13上获得包括αs1-和β-酪蛋白基因以及两个基因之间的19.6kb序列在内的81.5kb的DNA序列(pBACLinkSp-AD)，经过系统分析RP42-254I13的酶切图谱后，结果表明在RP42--254I13上含有100kb的CSN1S1和60kb的CSN2的上游序列。进一步通过生物信息学技术拼接出pBACLinkSp-AD的81.5kb的完整序列，进而以pBACLinkSp-AD重组质粒为基础，利用Red重组系统分别敲除牛CSN1S1和CSN2 3’侧翼间隔序列的18.7kb、14.5kb、10kb和5kb的DNA片段以及CSN1S1的13.5kb的编码区序列(CSN1S1基因的起始密码子和终止密码子之间的序列)，酶切分析结果表明Neo基因被引入到预测的位点，预测的DNA片断已被准确敲除。最后将敲除的DNA片断转染到小鼠乳腺上皮细胞，检测CSN1S1和CSN2基因在乳腺上皮细胞中的表达水平，结果显示转染敲除后五种质粒的小鼠乳腺上皮细胞能够扩增出牛CSN2基因的目的条带(310bp)，但不能扩增出牛CSN1S1的目的条带，至于在CSN1S1和CSN2间隔序列中是否含有基因的表达调控元件还需进一步鉴定。
本研究为进一步探索牛αs1-酪蛋白和β-酪蛋白基因上下游序列在牛酪蛋白基因表达调控中的作用和牛酪蛋白基因座控制区的定位研究奠定坚实的技术基础，同时，也为插入外源基因构建乳腺特异性表达载体奠定基础，因而将对乳腺生物反应器的研究尤其是奶牛乳腺生物反应器研究产生积极的影响。
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