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本试验研究了饲粮维生素A水平对生长期(育成期及冬毛期)水貂生长性能、营养物质消化率、血清生化指标、空肠微生物菌群和毛囊发育的影响,并探索了全反式视黄酸(维生素A主要活性产物)抑制体外培养的毛囊生长的调控机制,研究的主要内容如下:
1.育成期试验:选取雄性水貂90只,随机分成6组,每组15个重复,每个重复1只。每组水貂分别饲喂维生素A添加水平为0kIU/kg(VitA0)、5kIU/kg(VitA5)、20kIU/kg(VitA20)、80kIU/kg(VitA80)、320kIU/kg(VitA320)及1280kIU/kg(VitA1280)的饲粮(基础饲粮中维生素A的含量为1507IU/kg)。试验预饲期7天,正式期63天。结果表明:添加维生素A对水貂的末重、平均日增重呈现二次增加趋势(quadratic,P<0.05)。VitA0组对营养物质消化率较其他组显著降低(P<0.05),其中VitA20组的营养物质消化率最高。随着维生素A添加水平的增加,血清ALB含量呈线性及二次曲线降低(linear,quadratic,P<0.05)。血清TGs和LDL-C含量随饲粮维生素A的增加呈先降低后升高的趋势(quadratic,P<0.05)。维生素A添加水平对血清HDL-C含量影响显著(linear,quadratic,P<0.05)。维生素A添加水平对血清LDH、AST、ALP、ALT含量影响显著(P<0.05)。血清T-AOC的含量随着维生素A添加水平的提高呈先增高后降低的趋势(linear,quadratic,P<0.05)。
2.冬毛期试验:选取体重相近的90只健康的雄性貂皮随机分为6个组,每组15个重复,每个重复1只。维生素A添加水平分别为0kIU/kg(VitA0)、5kIU/kg(VitA5)、20kIU/kg(VitA20)、80kIU/kg(VitA80)、320kIU/kg(VitA320)及1280kIU/kg(VitA1280)的饲粮(基础饲料中维生素A的含量为1558IU/kg)。预饲期7天,正式期60天。结果表明:ADG随着饲粮中维生素A添加水平的增加呈二次趋势关系(P<0.05)。随维生素A的增加,营养物质的消化率呈现二次增加趋势(quadratic,P<0.05)。血清TC,LDL-C和ALP含量随维生素A添加水平的增加呈先降低后升高的二次趋势(quadratic,P<0.05)。饲粮中维生素A的增加会显著影响血清TGs的浓度(linear,P<0.05;quadratic,P<0.05)。血清TP、ALB、HDL-C、LDH、AST和ALT的浓度随饲粮维生素A水平的增加呈线性增加趋势(linear,P<0.05)。在饲粮中添加维生素A后,肝脏中视黄醇的含量显著增加(P<0.05)。在VitA0和VitA1280组的水貂肝组织切片中观察到明显的脂质液泡。结合育成期与冬毛期的试验结果,选取VitA0,VitA20和VitA1280组的水貂空肠肠段及内容物样品进行肠道形态学观察及16SrRNA高通量测序并分析。结果表明肠道绒毛长度呈现二次变化趋势(quadratic,P<0.01)。肌层厚度呈现线性增加趋势(P<0.05)。VitA0组肌层厚度显著低于VitA20和VitA1280组(P<0.05)。与VitA0组相比,VitA20和VitA1280组中的疣微菌门和拟杆菌门的丰度逐渐增加。添加维生素A水平为20kIU/kg时可以降低厚壁菌门/拟杆菌门比率,并提高了艾克曼菌属的丰度。维生素A的添加增加了水貂肠道有益微生物的丰度,降低了有害微生物丰度,提高了水貂肠道健康。胰蛋白酶活力与拟杆菌属,Ruminococcaceae_UCG-014,未培养Muribaculaceae,鞘氨醇单胞菌属,肠杆菌属呈显著负相关(P<0.05)。淀粉酶活力同棒状杆菌属_1,Clostridium_sensu_stricto_1,链球菌属呈现显著正相关(P<0.05)。脂肪酶活力与微生物均呈现正相关结果,但不显著。
3.在水貂毛囊的生长期(9月)、退行期(10月)及休止期(11月)随机从VitA0,VitA20和VitA1280组选取3只水貂,取背部皮肤,观察饲喂维生素A对水貂毛囊发育周期及TGF-β2基因表达量的影响。结果表明,水貂初级毛囊与次级毛囊处于同一生长周期,即生长期,毛乳头清晰可见,毛球延伸到皮下组织。10月水貂毛囊已逐步进入退行期,毛母质与毛乳头逐渐退化,向上萎缩,但VitA20组仍可见处于生长后期的毛囊。11月,初级毛囊与次级毛囊均已进入休止期,VitA20组水貂毛囊深度显著高于其他两组。在生长期VitA0组的TGF-β2相对表达量显著高于VitA20与VitA1280组(P<0.05)。退行期时,VitA0组的TGF-β2相对表达量与VitA20组差异显著(P<0.05)。休止期时,VitA1280组与VitA20、VitA1280组间差异显著(P<0.05)。所以在饲粮中添加维生素A可能会延长生长期的时间,缺乏或过量维生素A会导致退行期提前,并提高TGF-β2基因的表达量。
4.本试验将体外分离的毛囊在不同浓度的全反式视黄酸(ATRA)连续12天,测定毛囊长度、TGF-β2的基因和蛋白水平以及Smad2蛋白的磷酸化水平,观察ATRA对培养的水貂毛囊生长的抑制作用。并将毛乳头细胞(DPCs)在不同水平的ATRA培养后观察其对DPC的增殖和凋亡的影响。结果表明,ATRA可以抑制毛囊生长,促进TGF-β2表达并激活Smad2的磷酸化。此外,ATRA通过将细胞周期停在G1期来抑制细胞增殖,并通过提高Bax/Bcl-2的比例并激活caspase-3蛋白来诱导DPC凋亡。此外,TGF-β1及TGF-β2的抑制剂LY2109761可以在一定程度上减弱ATRA诱导DPCs细胞活力降低,凋亡和Smad2磷酸化水平的现象。
综合以上试验结果,饲粮中添加20kIU/kg维生素A可以通过促进肠道绒毛发育、提高机体抗氧化能力、改善肠道微生物菌群结构,从而提高水貂对营养物质的消化率及改善机体健康状态,进而提高生长期水貂的生长性能。但缺乏或过量维生素A(1280 kIU/kg)会对水貂生长、脂质代谢等方面产生负面影响。并且过量维生素A(1280 kIU/kg)可以导致毛囊生长期缩短,退行期提前到来,其机制为通过抑制TGF-β2/Smad2途径抑制DPCs增殖并诱导DPCs的凋亡来抑制毛囊的生长。
1.育成期试验:选取雄性水貂90只,随机分成6组,每组15个重复,每个重复1只。每组水貂分别饲喂维生素A添加水平为0kIU/kg(VitA0)、5kIU/kg(VitA5)、20kIU/kg(VitA20)、80kIU/kg(VitA80)、320kIU/kg(VitA320)及1280kIU/kg(VitA1280)的饲粮(基础饲粮中维生素A的含量为1507IU/kg)。试验预饲期7天,正式期63天。结果表明:添加维生素A对水貂的末重、平均日增重呈现二次增加趋势(quadratic,P<0.05)。VitA0组对营养物质消化率较其他组显著降低(P<0.05),其中VitA20组的营养物质消化率最高。随着维生素A添加水平的增加,血清ALB含量呈线性及二次曲线降低(linear,quadratic,P<0.05)。血清TGs和LDL-C含量随饲粮维生素A的增加呈先降低后升高的趋势(quadratic,P<0.05)。维生素A添加水平对血清HDL-C含量影响显著(linear,quadratic,P<0.05)。维生素A添加水平对血清LDH、AST、ALP、ALT含量影响显著(P<0.05)。血清T-AOC的含量随着维生素A添加水平的提高呈先增高后降低的趋势(linear,quadratic,P<0.05)。
2.冬毛期试验:选取体重相近的90只健康的雄性貂皮随机分为6个组,每组15个重复,每个重复1只。维生素A添加水平分别为0kIU/kg(VitA0)、5kIU/kg(VitA5)、20kIU/kg(VitA20)、80kIU/kg(VitA80)、320kIU/kg(VitA320)及1280kIU/kg(VitA1280)的饲粮(基础饲料中维生素A的含量为1558IU/kg)。预饲期7天,正式期60天。结果表明:ADG随着饲粮中维生素A添加水平的增加呈二次趋势关系(P<0.05)。随维生素A的增加,营养物质的消化率呈现二次增加趋势(quadratic,P<0.05)。血清TC,LDL-C和ALP含量随维生素A添加水平的增加呈先降低后升高的二次趋势(quadratic,P<0.05)。饲粮中维生素A的增加会显著影响血清TGs的浓度(linear,P<0.05;quadratic,P<0.05)。血清TP、ALB、HDL-C、LDH、AST和ALT的浓度随饲粮维生素A水平的增加呈线性增加趋势(linear,P<0.05)。在饲粮中添加维生素A后,肝脏中视黄醇的含量显著增加(P<0.05)。在VitA0和VitA1280组的水貂肝组织切片中观察到明显的脂质液泡。结合育成期与冬毛期的试验结果,选取VitA0,VitA20和VitA1280组的水貂空肠肠段及内容物样品进行肠道形态学观察及16SrRNA高通量测序并分析。结果表明肠道绒毛长度呈现二次变化趋势(quadratic,P<0.01)。肌层厚度呈现线性增加趋势(P<0.05)。VitA0组肌层厚度显著低于VitA20和VitA1280组(P<0.05)。与VitA0组相比,VitA20和VitA1280组中的疣微菌门和拟杆菌门的丰度逐渐增加。添加维生素A水平为20kIU/kg时可以降低厚壁菌门/拟杆菌门比率,并提高了艾克曼菌属的丰度。维生素A的添加增加了水貂肠道有益微生物的丰度,降低了有害微生物丰度,提高了水貂肠道健康。胰蛋白酶活力与拟杆菌属,Ruminococcaceae_UCG-014,未培养Muribaculaceae,鞘氨醇单胞菌属,肠杆菌属呈显著负相关(P<0.05)。淀粉酶活力同棒状杆菌属_1,Clostridium_sensu_stricto_1,链球菌属呈现显著正相关(P<0.05)。脂肪酶活力与微生物均呈现正相关结果,但不显著。
3.在水貂毛囊的生长期(9月)、退行期(10月)及休止期(11月)随机从VitA0,VitA20和VitA1280组选取3只水貂,取背部皮肤,观察饲喂维生素A对水貂毛囊发育周期及TGF-β2基因表达量的影响。结果表明,水貂初级毛囊与次级毛囊处于同一生长周期,即生长期,毛乳头清晰可见,毛球延伸到皮下组织。10月水貂毛囊已逐步进入退行期,毛母质与毛乳头逐渐退化,向上萎缩,但VitA20组仍可见处于生长后期的毛囊。11月,初级毛囊与次级毛囊均已进入休止期,VitA20组水貂毛囊深度显著高于其他两组。在生长期VitA0组的TGF-β2相对表达量显著高于VitA20与VitA1280组(P<0.05)。退行期时,VitA0组的TGF-β2相对表达量与VitA20组差异显著(P<0.05)。休止期时,VitA1280组与VitA20、VitA1280组间差异显著(P<0.05)。所以在饲粮中添加维生素A可能会延长生长期的时间,缺乏或过量维生素A会导致退行期提前,并提高TGF-β2基因的表达量。
4.本试验将体外分离的毛囊在不同浓度的全反式视黄酸(ATRA)连续12天,测定毛囊长度、TGF-β2的基因和蛋白水平以及Smad2蛋白的磷酸化水平,观察ATRA对培养的水貂毛囊生长的抑制作用。并将毛乳头细胞(DPCs)在不同水平的ATRA培养后观察其对DPC的增殖和凋亡的影响。结果表明,ATRA可以抑制毛囊生长,促进TGF-β2表达并激活Smad2的磷酸化。此外,ATRA通过将细胞周期停在G1期来抑制细胞增殖,并通过提高Bax/Bcl-2的比例并激活caspase-3蛋白来诱导DPC凋亡。此外,TGF-β1及TGF-β2的抑制剂LY2109761可以在一定程度上减弱ATRA诱导DPCs细胞活力降低,凋亡和Smad2磷酸化水平的现象。
综合以上试验结果,饲粮中添加20kIU/kg维生素A可以通过促进肠道绒毛发育、提高机体抗氧化能力、改善肠道微生物菌群结构,从而提高水貂对营养物质的消化率及改善机体健康状态,进而提高生长期水貂的生长性能。但缺乏或过量维生素A(1280 kIU/kg)会对水貂生长、脂质代谢等方面产生负面影响。并且过量维生素A(1280 kIU/kg)可以导致毛囊生长期缩短,退行期提前到来,其机制为通过抑制TGF-β2/Smad2途径抑制DPCs增殖并诱导DPCs的凋亡来抑制毛囊的生长。