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精子发生（Spermatogenesis）是一个复杂而精细的调控过程，目前关于它的研究多集中在基因和药物水平，而对此过程中调控网络的系统研究却很少涉及。本研究旨在探索鸡精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSC)向精子发生过程中新的调控网络，通过对减数分裂关键基因Stra8上游miRNA(microRNA，miRNA)的研究，分析减数分裂过程中TF(Transcription factors，TF)-miRNA-Stra8的调节机理以及lncRNA(Long non-coding RNA，IncRNA)-miRNA-Stra8的竞争调节机制，以期深入解析鸡精子发生过程中TF、miRNA、lncRNA和Stra8的分子调控网络。基于此目标，本文以家鸡为研究对象，采用miRNA-seq技术对视黄酸(Retinoic acid，RA)诱导胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC)向雄性生殖细胞分化过程关键节点细胞的miRNA进行研究，筛选出参与ESC向SSC分化且可能调控Stra8的关键miRNA，并结合体内外实验验证该miRNA与Stra8及减数分裂的关系;最后对该miRNA的转录及调控机制(TF-miRNA-Stra8和lncRNA-miRNA-Stra8)进行了进一步的探究，以期为阐明精子发生机制以及ESC向精子定向分化诱导体系的建立提供理论和实验基础。
研究结果如下:
(1)为了探究RA诱导ESC分化的具体调控机制及该过程中受RA调控基因Stra8表达差异不显著的原因，对RA诱导过程中关键时间点的细胞、与其相同时间节点的自分化ESC和刚分离的ESC进行miRNAs测序，分析其中可能参与生殖细胞分化的关键miRNAs，并利用qRT-PCR分别对它们在OdESC(c_0)、RA诱导第4d/lOd(R_4/R10)、自分化第4d/10d(z_4/z10)、PGC（Primordial germ cell，PGC）和SSC中的表达量进行了检测。结果发现:gga-miR-146c-5p、gga-miR-148a-3p、gga-miR-21-5p和gga-miR-30d四个miRNAs在c_0、R_4、R10、z_4和z10中均高表达，且它们的靶基因均与细胞分化相关，其中gga-miR-30d、gga-miR-21-5p和gga-miR-148a-3p的靶基因与雄性生殖细胞发育及分化相关，且富集到Notch、GnRH、MAPK和TGF-β等信号通路;对z_4vs c_0与R_4vs c_0分析，发现包括gga-miR-31-5p在内的55个差异miRNA，z10vs c_0与R10vs c_0相比，发现包括gga-miR-148a-3p在内的77个miRNAs，而对比R_4vs c_0和z10vs c_0仅有两个共有的差异miRNA，且这两个miRNA对生殖细胞的形成具有重要作用;对比在PGC/SSC/SP(Spermatogonia，SP)中miRNA的测序结果，发现在RA诱导过程中，上述三种细胞中的包括gga-miR-30d在内差异miRNAs的表达趋势与RA诱导过程中基本一致;靶向Stra8的gga-miR-31-5p等也在RA诱导过程中也呈上调表达。以上结果表明gga-miR-31-5p等miRNA极有可能参与调控ESC向SSC分化并影响Stra8表达。
(2)为了更好地探究调控Stra8基因表达的分子调控机制，本研究利用3RACE技术扩增Stra8的3UTR，利用生物信息学在线软件Targetscan和miRBase反向预测靶向鸡Stra8基因的miRNAs，分别构建了各miRNA的过表达载体及Stra83UTR荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶活性报告系统和突变miRNA结合位点确定了靶向Stra8的关键miRNA，并构建其干扰载体;同时利用免疫法制备anti-Stra8血清;利用qRT-PCR对不同细胞中关键miRNA和Stra8的表达谱进行检测;在体外，以过表达和干扰关键miRNA的方式处理SSC并结合RA诱导，通过流式细胞分析细胞倍型和qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达变化;在体内，通过对性成熟的公鸡进行睾丸注射、测定精液量、精子密度、qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达和睾丸组织HE染色。结果显示:成功构建各miRNA的过表达载体和Stra83UTR双荧光素酶报告载体，以及gga-miR-31-5p突变位点的Stra83UTR荧光素酶报告载体;双荧光素酶活性检测显示，gga-miR-31-5p对Stra8的抑制活性最佳，且突变位点后的双荧光素酶活性检测结果显示，gga-miR-31-5p直接可靶向Stra8;在细胞中过表达/干扰gga-miR-3l-5p后，Stra8与gga-miR-31-5p表达方式呈相反状态;Elisa结果显示成功制备抗Stra8血清;体外流式细胞分析发现，过表达gga-miR-31-5p后，单倍体形成效率极显著下降(P＜0.01)，qRT-PCR结果显示过表达gga-miR-31-5p可极显著下调Stra8等减数分裂相关基因的表达量（P＜O.01）;体内实验表明，过表达gga-miR-31-5p使公鸡的精液量和精子密度极显著下降(P＜0.01)，同时qRT-PCR结果显示Stra8等减数分裂相关基因表达量显著下调（P＜0.05），WB显示Stra8蛋白表达显著受到抑制，HE染色结果显示过表达gga-miR-31-5p使睾丸组织松散、管腔内精子含量较少。以上结果表明，gga-miR-31-5p靶向Stra8，通过抑制Stra8表达调控精子形成。
(3)为了系统有效地阐明在不同细胞中添加RA后gga-miR-31-5p的表达差异，本研究结合UCSC和NCBI数据库查询gga-miR-31-5p的pre-miRNA上游2180bp左右序列，扩增出全长，置换pEGFP-N1载体中的CMV启动子，构建重组载体pEGFP-miR-31-2180，转染至DF-1细胞中确定该片段是否有启动活性;通过构建gga-miR-31-5p启动子区域不同缺失片段，pGL3-584、pGL3-1344和pGL3-2180，转染DF-1后利用双荧光素酶报告系统，筛查出gga-miR-31-5p启动子区域可能存在的重要调控元件;分别将gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子转染DF-1/ESC/SSC细胞，经RA处理后，利用双荧光素酶报告系统检测RA对各启动子作用情况，同时将gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子进行共转染，经RA处理后，检测各自受RA调控情况;筛查仅作用于gga-miR-31-5p启动子且在ESC和SSC中差异表达的转录因子，并构建其结合位点缺失载体，同样以双荧光素酶报告系统检测过表达/干扰转录因子/缺失结合位点后对gga-miR-31-Sp启动子活性的影响;最后分别用l0-6M TSA和10-5M RA对转染gga-miR-31-5p启动子的DF-1细胞进行处理，双荧光素酶活性报告系统检测gga-miR-31-5p启动子活性变化，qRT-PCR检测经TSA和RA处理的ESC/SSC中gga-miR-31-5p的表达变化。测序结果表明成功构建了pEGFP-miR-31-2180，且该载体转染DF-1细胞后能表达绿色荧光，说明其具有启动活性;启动子各缺失片段的测序结果也表明载体构建成功，双荧光素酶活性检测进一步确定了gga-miR-31-5p启动子2180bp具有启动活性;发现仅在gga-miR-31-5p启动子-2180bp--1344bp区域存在RARa、c-Jun、HNF-4a、REV-ErbA、ER和HNF-1等结合位点，其中RA可增强gga-miR-31-5p启动活性，且gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子竞争性结合RA;而且还发现转录因子c-jun抑制gga-miR-31-5p启动活性，当c-jun大量存在时，RA对gga-miR-31-5p的启动活性作用不明显:此外，还发现当添加TSA后，gga-miR-31-5p启动子活性受到显著抑制（P＜0.05），经TSA或TSA和RA联合处理后的ESC/SSC中gga-miR-31-5p表达极显著降低（P＜0.01），仅在ESC中经RA处理后可使gga-miR-31-5p表达上调。以上结果表明，c-jun对gga-miR-31-5p的启动子的抑制作用强于RA对gga-miR-31-5p的启动子激活作用，当组蛋白乙酰化发生时，抑制gga-miR-31-5p的转录。
(4)为了探究是否存在lncRNA-gga-miR-31-5p-Stra8ceRNA机制，本研究结合RA诱导ESC分化过程中的lncRNA测序，对lncRNA-miRNA进行联合分析，筛选与gga-miR-31-5p互作的lncRNA，并构建其过表达载体，将lncRNA、gga-miR-31-5p和Stra83UTR荧光素酶报告载体共转染DF-1，利用双荧光素酶报告系统检测与Stra8竞争结合gga-miR-31-5p的lncRNA;构建该lncRNA的gga-miR-31-5p结合位点突变载体，进一步确认其竞争关系;同时，针对关键lncRNA设计4个干扰靶点，并构建其干扰载体，通过荧光定量及双荧光素酶活性检测确定最佳干扰活性载体;在体外，分别过表达和干扰lncRNA-IMS，并设立lncRNA与gga-miR-31-5p共转染组，并结合RA诱导，采用流式细胞分析细胞倍型，qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达变化;在体内，通过对性成熟的公鸡进行睾丸注射，对精液量和精子密度检测，以及qRT-PCR检测减数分裂相关基因，睾丸组织HE染色，以确定关键lncRNA对精子形成的作用。结果显示成功构建3个lncRNA的过表达载体、lncRNA-IMS的gga-miR-31-5p结合位点突变载体以及lncRNA-IMS的4个干扰载体，双荧光素酶报告检测显示，lncRNA-IMS为关键lncRNA，且与Stra8竞争性结合gga-miR-31-5p，通过qRT-PCR及双荧光素酶活性报告系统确定了最佳干扰载体为shIMS-2;体外实验表明，过表达lncRNA-IMS使单倍体形成效率显著上升(P＜0.01)，Stra8等减数分裂相关基因表达量显著下调(P＜0.01)，而干扰后则呈现完全相反的结果。而gga-miR-31-5p表达水平均未发生变化;同时过表达IncRNA-IMS和gga-miR-31-5p，无论是细胞倍型或是减数分裂相关基因均未发生改变，仅gga-miR-31-5p表达上调;体内实验表明，过表达LncRNA-IMS使公鸡的精子密度极显著上升(P＜0.01)，且Stra8等减数分裂相关基因表达量极显著上调（P＜0.01），HE染色结果显示，过表达LncRNA-IMS后睾丸组织结构完整，各级精细胞排列整密，管腔内精子含量较多;而干扰后则使精液量和精子密度极显著下降(P＜0.01)、Stra8等减数分裂相关基因表达极显著下调(P＜0.01)，睾丸组织结构松散，各级精细胞较少，管腔较大，腔内精子含量较少;同时过表达LncRNA-IMS和gga-miR-31-5p，精液量和精子密度，减数分裂相关基因均未发生变化(P＞0.05)，睾丸组织结构完整，管腔内精子含量较多。表明LncRNA-IMS通过与Stra8竞争结合gga-miR-31-5p，减少gga-miR-31-Sp对Stra8的抑制作用，从而促进机体内的精子发生。
以上研究显示，在调控减数分裂的过程中组蛋白乙酰化、c-jun和RA共同调控gga-miR-31-5p的表达，从而影响Stra8的表达，同时细胞中所存在的LncRNA-IMS竞争性结合gga-miR-31-5p，继而阻止gga-miR-31-5p对Stra8的抑制作用，促进雄性生殖细胞发生减数分裂，提高精子生成数量。
研究结果如下:
(1)为了探究RA诱导ESC分化的具体调控机制及该过程中受RA调控基因Stra8表达差异不显著的原因，对RA诱导过程中关键时间点的细胞、与其相同时间节点的自分化ESC和刚分离的ESC进行miRNAs测序，分析其中可能参与生殖细胞分化的关键miRNAs，并利用qRT-PCR分别对它们在OdESC(c_0)、RA诱导第4d/lOd(R_4/R10)、自分化第4d/10d(z_4/z10)、PGC（Primordial germ cell，PGC）和SSC中的表达量进行了检测。结果发现:gga-miR-146c-5p、gga-miR-148a-3p、gga-miR-21-5p和gga-miR-30d四个miRNAs在c_0、R_4、R10、z_4和z10中均高表达，且它们的靶基因均与细胞分化相关，其中gga-miR-30d、gga-miR-21-5p和gga-miR-148a-3p的靶基因与雄性生殖细胞发育及分化相关，且富集到Notch、GnRH、MAPK和TGF-β等信号通路;对z_4vs c_0与R_4vs c_0分析，发现包括gga-miR-31-5p在内的55个差异miRNA，z10vs c_0与R10vs c_0相比，发现包括gga-miR-148a-3p在内的77个miRNAs，而对比R_4vs c_0和z10vs c_0仅有两个共有的差异miRNA，且这两个miRNA对生殖细胞的形成具有重要作用;对比在PGC/SSC/SP(Spermatogonia，SP)中miRNA的测序结果，发现在RA诱导过程中，上述三种细胞中的包括gga-miR-30d在内差异miRNAs的表达趋势与RA诱导过程中基本一致;靶向Stra8的gga-miR-31-5p等也在RA诱导过程中也呈上调表达。以上结果表明gga-miR-31-5p等miRNA极有可能参与调控ESC向SSC分化并影响Stra8表达。
(2)为了更好地探究调控Stra8基因表达的分子调控机制，本研究利用3RACE技术扩增Stra8的3UTR，利用生物信息学在线软件Targetscan和miRBase反向预测靶向鸡Stra8基因的miRNAs，分别构建了各miRNA的过表达载体及Stra83UTR荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶活性报告系统和突变miRNA结合位点确定了靶向Stra8的关键miRNA，并构建其干扰载体;同时利用免疫法制备anti-Stra8血清;利用qRT-PCR对不同细胞中关键miRNA和Stra8的表达谱进行检测;在体外，以过表达和干扰关键miRNA的方式处理SSC并结合RA诱导，通过流式细胞分析细胞倍型和qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达变化;在体内，通过对性成熟的公鸡进行睾丸注射、测定精液量、精子密度、qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达和睾丸组织HE染色。结果显示:成功构建各miRNA的过表达载体和Stra83UTR双荧光素酶报告载体，以及gga-miR-31-5p突变位点的Stra83UTR荧光素酶报告载体;双荧光素酶活性检测显示，gga-miR-31-5p对Stra8的抑制活性最佳，且突变位点后的双荧光素酶活性检测结果显示，gga-miR-31-5p直接可靶向Stra8;在细胞中过表达/干扰gga-miR-3l-5p后，Stra8与gga-miR-31-5p表达方式呈相反状态;Elisa结果显示成功制备抗Stra8血清;体外流式细胞分析发现，过表达gga-miR-31-5p后，单倍体形成效率极显著下降(P＜0.01)，qRT-PCR结果显示过表达gga-miR-31-5p可极显著下调Stra8等减数分裂相关基因的表达量（P＜O.01）;体内实验表明，过表达gga-miR-31-5p使公鸡的精液量和精子密度极显著下降(P＜0.01)，同时qRT-PCR结果显示Stra8等减数分裂相关基因表达量显著下调（P＜0.05），WB显示Stra8蛋白表达显著受到抑制，HE染色结果显示过表达gga-miR-31-5p使睾丸组织松散、管腔内精子含量较少。以上结果表明，gga-miR-31-5p靶向Stra8，通过抑制Stra8表达调控精子形成。
(3)为了系统有效地阐明在不同细胞中添加RA后gga-miR-31-5p的表达差异，本研究结合UCSC和NCBI数据库查询gga-miR-31-5p的pre-miRNA上游2180bp左右序列，扩增出全长，置换pEGFP-N1载体中的CMV启动子，构建重组载体pEGFP-miR-31-2180，转染至DF-1细胞中确定该片段是否有启动活性;通过构建gga-miR-31-5p启动子区域不同缺失片段，pGL3-584、pGL3-1344和pGL3-2180，转染DF-1后利用双荧光素酶报告系统，筛查出gga-miR-31-5p启动子区域可能存在的重要调控元件;分别将gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子转染DF-1/ESC/SSC细胞，经RA处理后，利用双荧光素酶报告系统检测RA对各启动子作用情况，同时将gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子进行共转染，经RA处理后，检测各自受RA调控情况;筛查仅作用于gga-miR-31-5p启动子且在ESC和SSC中差异表达的转录因子，并构建其结合位点缺失载体，同样以双荧光素酶报告系统检测过表达/干扰转录因子/缺失结合位点后对gga-miR-31-Sp启动子活性的影响;最后分别用l0-6M TSA和10-5M RA对转染gga-miR-31-5p启动子的DF-1细胞进行处理，双荧光素酶活性报告系统检测gga-miR-31-5p启动子活性变化，qRT-PCR检测经TSA和RA处理的ESC/SSC中gga-miR-31-5p的表达变化。测序结果表明成功构建了pEGFP-miR-31-2180，且该载体转染DF-1细胞后能表达绿色荧光，说明其具有启动活性;启动子各缺失片段的测序结果也表明载体构建成功，双荧光素酶活性检测进一步确定了gga-miR-31-5p启动子2180bp具有启动活性;发现仅在gga-miR-31-5p启动子-2180bp--1344bp区域存在RARa、c-Jun、HNF-4a、REV-ErbA、ER和HNF-1等结合位点，其中RA可增强gga-miR-31-5p启动活性，且gga-miR-31-5p启动子与Stra8启动子竞争性结合RA;而且还发现转录因子c-jun抑制gga-miR-31-5p启动活性，当c-jun大量存在时，RA对gga-miR-31-5p的启动活性作用不明显:此外，还发现当添加TSA后，gga-miR-31-5p启动子活性受到显著抑制（P＜0.05），经TSA或TSA和RA联合处理后的ESC/SSC中gga-miR-31-5p表达极显著降低（P＜0.01），仅在ESC中经RA处理后可使gga-miR-31-5p表达上调。以上结果表明，c-jun对gga-miR-31-5p的启动子的抑制作用强于RA对gga-miR-31-5p的启动子激活作用，当组蛋白乙酰化发生时，抑制gga-miR-31-5p的转录。
(4)为了探究是否存在lncRNA-gga-miR-31-5p-Stra8ceRNA机制，本研究结合RA诱导ESC分化过程中的lncRNA测序，对lncRNA-miRNA进行联合分析，筛选与gga-miR-31-5p互作的lncRNA，并构建其过表达载体，将lncRNA、gga-miR-31-5p和Stra83UTR荧光素酶报告载体共转染DF-1，利用双荧光素酶报告系统检测与Stra8竞争结合gga-miR-31-5p的lncRNA;构建该lncRNA的gga-miR-31-5p结合位点突变载体，进一步确认其竞争关系;同时，针对关键lncRNA设计4个干扰靶点，并构建其干扰载体，通过荧光定量及双荧光素酶活性检测确定最佳干扰活性载体;在体外，分别过表达和干扰lncRNA-IMS，并设立lncRNA与gga-miR-31-5p共转染组，并结合RA诱导，采用流式细胞分析细胞倍型，qRT-PCR检测减数分裂相关基因表达变化;在体内，通过对性成熟的公鸡进行睾丸注射，对精液量和精子密度检测，以及qRT-PCR检测减数分裂相关基因，睾丸组织HE染色，以确定关键lncRNA对精子形成的作用。结果显示成功构建3个lncRNA的过表达载体、lncRNA-IMS的gga-miR-31-5p结合位点突变载体以及lncRNA-IMS的4个干扰载体，双荧光素酶报告检测显示，lncRNA-IMS为关键lncRNA，且与Stra8竞争性结合gga-miR-31-5p，通过qRT-PCR及双荧光素酶活性报告系统确定了最佳干扰载体为shIMS-2;体外实验表明，过表达lncRNA-IMS使单倍体形成效率显著上升(P＜0.01)，Stra8等减数分裂相关基因表达量显著下调(P＜0.01)，而干扰后则呈现完全相反的结果。而gga-miR-31-5p表达水平均未发生变化;同时过表达IncRNA-IMS和gga-miR-31-5p，无论是细胞倍型或是减数分裂相关基因均未发生改变，仅gga-miR-31-5p表达上调;体内实验表明，过表达LncRNA-IMS使公鸡的精子密度极显著上升(P＜0.01)，且Stra8等减数分裂相关基因表达量极显著上调（P＜0.01），HE染色结果显示，过表达LncRNA-IMS后睾丸组织结构完整，各级精细胞排列整密，管腔内精子含量较多;而干扰后则使精液量和精子密度极显著下降(P＜0.01)、Stra8等减数分裂相关基因表达极显著下调(P＜0.01)，睾丸组织结构松散，各级精细胞较少，管腔较大，腔内精子含量较少;同时过表达LncRNA-IMS和gga-miR-31-5p，精液量和精子密度，减数分裂相关基因均未发生变化(P＞0.05)，睾丸组织结构完整，管腔内精子含量较多。表明LncRNA-IMS通过与Stra8竞争结合gga-miR-31-5p，减少gga-miR-31-Sp对Stra8的抑制作用，从而促进机体内的精子发生。
以上研究显示，在调控减数分裂的过程中组蛋白乙酰化、c-jun和RA共同调控gga-miR-31-5p的表达，从而影响Stra8的表达，同时细胞中所存在的LncRNA-IMS竞争性结合gga-miR-31-5p，继而阻止gga-miR-31-5p对Stra8的抑制作用，促进雄性生殖细胞发生减数分裂，提高精子生成数量。