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缺血性脑卒中,又称中风,是一种急性脑血管疾病,由血管狭窄或者堵塞造成脑组织血流灌注不足而引起。脑卒中造成不可逆的神经损伤,严重影响患者的运动功能、感觉功能和认知能力。目前脑卒中的临床治疗药物十分有限,以溶栓药组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator,tPA）为主,但是tPA的使用受到很多限制,真正受益的患者很少。脑卒中复杂的病理机制是造成抗脑卒中药物研发困难的主要原因之一。因此急需对脑卒中的病理机制进行深入研究,并在此基础上寻找潜在的药物干预新靶标。自噬是一种通过溶酶体途径的细胞内降解过程,自噬清除损伤蛋白和细胞器,对维持细胞内稳态十分关键。本课题组前期研究表明,脑卒中后的血流复灌过程引发自噬激活,自噬通过清除损伤线粒体,即线粒体自噬,减少神经元凋亡并减轻缺血性神经损伤。线粒体外膜蛋白BNIP3L/NIX通过与自噬泡蛋白LC3相互作用介导了缺血/复灌过程中的线粒体自噬。然而,课题组前期研究初步发现,在单一的缺血过程中神经元虽有自噬激活,线粒体却未被有效清除,即存在线粒体自噬缺失。如能明确缺血过程中神经元的线粒体自噬缺失的机制并对其进行逆转,则可能为治疗缺血性脑损伤提供新的策略。第一部分BNIP3L丢失导致缺血损伤神经元中的线粒体自噬缺失为进一步明确永久缺血过程中的线粒体自噬缺失,本研究利用蛋白免疫印迹法检测小鼠缺血（MCAO）脑内线粒体自噬的情况。结果显示,无论是缺血再灌（tMCAO）和永久性脑缺血（pMCAO）后,均出现自噬相关蛋白SQSTM1降低、LC3增加,提示自噬激活。在tMCAO小鼠脑内,线粒体标志蛋白COX4I1及TOMM20水平降低,提示线粒体自噬发生;而在pMCAO中COX4I1及TOMM20水平未发生改变,提示线粒体自噬缺失。在体外培养的神经元中,通过氧糖剥夺再灌（O-R）和氧糖剥夺不复灌（OGD）模拟缺血神经损伤,蛋白免疫印迹检测线粒体自噬的指标。结果表明,OGD情况下,线粒体自噬缺失。进一步用活细胞共聚焦显微成像检测培养神经元缺血后线粒体与自噬泡的共定位,结果显示在O-R后,线粒体与自噬泡的共定位增加;而OGD不能减少线粒体含量且未发现线粒体与自噬泡共定位,提示永久缺血后线粒体自噬缺失。不仅如此,溶酶体抑制剂氯喹和自噬相关基因7（ATG7）敲除均不影响OGD后培养神经元线粒体含量,提示缺血后线粒体自噬缺失并非由自噬泡功能不全引起,而可能与选择性线粒体自噬障碍有关。进一步对线粒体自噬相关蛋白Parkin、FUNDC1、Bcl2-L-13、Prohibitin2和BNIP3L/NIX进行检测,发现仅有线粒体自噬受体BNIP3L/NIX蛋白水平随缺血时间延长而下降。重组腺相关病毒转染小鼠皮层和纹状体过表达BNIP3L,可逆转缺血后BNIP3L的丢失并促进线粒体自噬,提示缺血脑组织内线粒体自噬缺失与BNIP3L蛋白下调密切相关。BNIP3L以单体和二聚体的形式存在,我们观察到缺血神经元BNIP3L的丢失以其二聚体为主。在HeLa细胞中过表达野生型和单体突变的BNIP3L（S195A,G203A）,发现单体突变BNIP3L无法诱导线粒体自噬,也无法与LC3-II结合。为了进一步明确二聚体BNIP3L在脑缺血诱导线粒体自噬中的作用,在培养神经元中分别过表达野生型和单体突变（G203A）的BNIP3L,OGD后发现野生型BNIP3L可以显著降低线粒体的含量,而单体BNIP3L（G203A）则未能减少线粒体含量。在野生型小鼠中利用重组腺相关病毒分别过表达BNIP3L和单体突变BNIP3L（G203A）并进行缺血造模,只有高表达野生型BNIP3L能逆转脑缺血后的线粒体自噬缺失并减少缺血脑梗死体积,而高表达单体突变BNIP3L（G203A）不能逆转线粒体自噬缺失,也不能减少缺血脑梗死体积。上述结果表明,BNIP3L形成二聚体是其诱导线粒体自噬进而发挥神经保护作用所必需的,BNIP3L二聚体的减少是缺血脑组织中线粒体自噬缺失的关键因素。本部分研究首次明确了在永久性缺血神经元中,BNIP3L二聚体蛋白水平下调导致了线粒体自噬功能缺陷。然而BNIP3L通过何种机制下调,逆转BNIP3L下调是否能逆转线粒体自噬缺失等关键问题仍有待明确。因此本论文第二部分将就上述问题进行研究。第二部分卡非佐米抑制BNIP3L降解促进线粒体自噬并减少脑缺血损伤为了进一步明确BNIP3L的降解途径,小鼠pMCAO后即刻侧脑室给予自噬抑制剂3-MA和泛素-蛋白酶体抑制剂MG132。结果显示只有MG132可以逆转缺血脑组织内的BNIP3L降解,提示BNIP3L可能经由泛素-蛋白酶体途径降解。我们利用免疫共沉淀法分别检测野生型和单体突变BNIP3L的泛素化水平。发现在bnip3l敲除的HeLa细胞中,无论是否诱导线粒体自噬,BNIP3L二聚体泛素化水平均高于其单体,提示BNIP3L二聚体更易被泛素-蛋白酶体降解。进一步,通过腺相关病毒在小鼠脑内分别高表达野生型和单体突变BNIP3L（G203A）并行pMCAO手术。结果显示,在缺血脑组织中,野生型和单体突变BNIP3L（G203A）均能被泛素化,且蛋白酶体抑制剂MG132可以逆转缺血小鼠脑内BNIP3L的降解,逆转线粒体自噬缺失。结合前述发现,该结果提示BNIP3L的二聚体和单体形式均能被泛素化降解,而二聚体BNIP3L的泛素化降解可能是线粒体自噬缺失的原因。我们因此推测蛋白酶体抑制剂或能通过抑制BNIP3L降解,恢复线粒体自噬,进而发挥抗脑缺血损伤作用。实验发现临床用于治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂卡非佐米,同样可逆转BNIP3L的降解,促进缺血脑组织中的线粒体自噬。卡非佐米在缺血后3 h内给药可显著降低由MCAO所致小鼠急性脑缺血损伤,该保护作用在bnip3l-/-小鼠中消失,提示卡非佐米通过抑制BNIP3L降解发挥抗脑缺血损伤作用。此外,卡非佐米在小鼠脑缺血后14 d内可显著减少脑梗死并改善运动功能。上述结果表明,脑缺血后BNIP3L二聚体通过泛素蛋白酶体途径降解进而造成线粒体自噬缺失;卡非佐米通过抑制BNIP3L的丢失逆转线粒体自噬缺失,并发挥神经保护作用。综上所述,本论文首次发现在永久性脑缺血后,神经元中BNIP3L,尤其是其二聚体形式,通过泛素-蛋白酶体降解导致了线粒体自噬缺失。蛋白酶体抑制剂卡非佐米可以抑制BNIP3L降解,进而促进线粒体自噬,最终发挥抗脑缺血损伤的作用。以上研究揭示了缺血神经元中线粒体自噬的一种新的调控方式,为临床利用蛋白酶体抑制剂干预脑缺血损伤提供了重要的实验依据。