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目的:本实验旨在探究伪原薯蓣皂苷(pseudoprotodioscin,PPD)对人子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和自噬的影响。并探讨mi R-182-5P是否通过靶向Fox O1参与伪原薯蓣皂苷抗肿瘤的作用,以初步探索其作用机制。方法:一、PPD对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响1.采用MTT实验检测不同浓度、不同作用时间下,PPD处理子宫内膜癌细胞后的生长情况,筛选实验所需的药物浓度。2.应用划痕实验检测80μg/m L PPD作用于子宫内膜癌细胞24 h、48 h和72 h之后,对细胞迁移的影响。3.应用Transwell实验检测80μg/m L PPD作用子宫内膜癌细胞24 h后,细胞侵袭情况。二、PPD对子宫内膜癌细胞凋亡和自噬的影响1.采用Annexin V-FITC/PI双染实验检测PPD对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。实验分组:Ctrl组和PPD处理组。2.使用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位,实验分为3组:Ctrl组加入新鲜培基,处理组分别加入40μg/m L、80μg/m L的PPD孵育48 h,TMRM孵育30 min后,去除染色液进行拍照。3.转染Ad Plus-m Cherry-GFP-LC3B腺病毒,利用激光共聚焦显微镜测定PPD对子宫内膜癌细胞自噬的影响。实验分组:Ctrl组和PPD处理组。4.Western Blot检测凋亡和自噬相关蛋白的表达。5.流式细胞术检测抑制细胞自噬后PPD对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。实验分为4组,分别为Ctrl、3-MA、PPD和PPD+3-MA,处理组3-MA 0.5 m M、PPD 80μg/m L和PPD 80μg/m L+3-MA 0.5 m M分别作用于HEC-1A和Ishikawa细胞48 h,FCM检测细胞凋亡率。三、PPD调控mi R-182-5P和Fox O1对子宫内膜癌细胞生物功能学的影响1.采用RT-q PCR检测PPD对子宫内膜癌细胞相关mi RNAs的影响。2.利用RT-q PCR检测mi R-182-5P的转染效率。3.通过脂质体介导瞬时转染mi R-182-5p mimics上调mi R-182-5p表达,结合PPD处理子宫内膜癌细胞后,利用MTT、划痕实验、transwell和流式细胞术分析mi R-182-5p过表达对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。4.通过Target Scan Human预测mi R-182-5P的靶蛋白。再运用WB验证mi R-182-5P和Fox O1是否存在直接靶向关系以及凋亡和自噬蛋白表达情况。同时,在实验中使用Fox O1的抑制剂AS1842856,进一步研究Fox O1对凋亡和自噬的影响。结果:一、PPD对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响1.PPD能够显著抑制子宫内膜癌细胞增殖,与Ctrl组相比,随PPD浓度增加抑制作用随之增强(P<0.01),且呈浓度依赖性增加。MTT实验测得子宫内膜癌细胞的IC50值80μg/m L,将作为之后部分实验用药浓度。2.PPD能抑制细胞迁移,与Ctrl组相比,随PPD作用时间延长迁移率降低。3.PPD能抑制细胞侵袭,与Ctrl组相比,随PPD作用时间延长细胞侵袭数目显著降低。二、PPD对子宫内膜癌细胞凋亡和自噬的影响1.用流式细胞仪测得的结果显示,与Ctrl组比较,随着PPD浓度升高细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。2.激光共聚焦结果显示,与Ctrl组比较,处理组线粒体膜电位明显降低。3.未处理的Ctrl组,激光共聚焦显微镜只能观察到细胞出现少量的黄色和红色荧光斑点。而PPD处理组,共聚焦结果显示胞浆中黄色和红色斑点均明显增加,说明自噬小体和自噬溶酶体的数量增多,可以认为PPD能诱导子宫内膜癌细胞自噬。4.WB检测凋亡和自噬相关蛋白表达水平的变化,实验结果发现,与Ctrl组相比,PPD处理组Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase3/Pro-Caspase3、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值明显增加。且PPD作用24 h时的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值高于48 h。5.实验采用PPD联合3-MA处理,流式细胞仪检测PPD对子宫内膜癌细胞凋亡的作用,结果显示抑制自噬能够促进PPD诱导的细胞凋亡。三、PPD调控mi R-182-5P和Fox O1对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响1.80μg/m L的PPD处理子宫内膜癌细胞48 h后,应用RT-q PCR方法检测人子宫内膜癌细胞系HEC-1A和Ishikawa内10个mi RNAs的相对表达情况。检测结果显示与Ctrl组相比,PPD处理组的10个mi RNAs中mi R-182-5P表达下调最大(P<0.01)。实验后续主要研究过表达mi R-182-5P对子宫内膜癌细胞的生物学功能的影响。2.RT-q PCR检测转染组HEC-1A和Ishikawa中mi R-182-5P表达情况。结果显示,与Mock组相比,转染mi R-182-5P mimics后,HEC-1A和Ishikawa细胞中mi R-182-5P表达明显上调,说明转染成功。3.MTT、划痕实验和Transwell实验检测结果显示,NC+PPD组和mi R-182-5P mimics+PPD组细胞增殖、迁移和侵袭能力均明显低于Mock组;与NC+PPD组相比,mi R-182-5P mimics+PPD组细胞增殖、迁移和侵袭能力明显升高,说明上调mi R-182-5P可以促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡。4.运用Target Scan Human靶标预测,我们发现mi R-182-5P与Fox O1的碱基序列间存在互补序列,有部分结合位点。WB进一步验证,结果显示(P<0.05),与Mock组相比,NC+PPD组、mi R-182-5P mimics+PPD组和AS1842856+PPD组Fox O1的蛋白表达水平升高,其中NC+PPD组的蛋白表达量高于mi R-182-5P mimics+PPD组,表明PPD能够通过下调mi R-182-5P表达进而上调Fox O1的表达。WB检测凋亡和自噬蛋白表达情况,结果显示,与Mock组相比,处理组NC+PPD、mi R-182-5P mimics+PPD和AS1842856+PPD组的凋亡和自噬蛋白比值明显升高;与NC+PPD组相比,mi R-182-5P mimics+PPD的凋亡和自噬蛋白比值较低,提示过表达mi R-182-5P能够抑制细胞凋亡和自噬;与NC+PPD组相比,AS1842856+PPD组凋亡和自噬蛋白比值较低,提示下调Fox O1蛋白的表达,抑制了子宫内膜癌细胞凋亡和自噬。结论:1.PPD能够抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭。2.PPD能够引发线粒体功能障碍,促进凋亡和自噬。并且PPD诱发的自噬抑制了子宫内膜癌细胞凋亡。3.PPD能够下调子宫内膜癌细胞中mi R-182-5P的表达;过表达mi R-182-5P能够提高子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭,降低PPD诱导的细胞凋亡和自噬;过表达mi R-182-5P进而下调Fox O1蛋白的表达,从而抑制子宫内膜癌细胞凋亡和自噬。