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hepcidin是一类新颖的小分子抗菌多肽,其不仅具有广谱抗菌活性,还被认为是一种关键的铁代谢调节因子,在鱼类中分布广泛。为有效防治养殖鱼类病毒、细菌(特别是耐药菌)和寄生虫感染的疾病,抗菌肽作为可替代抗生素的药物、饲料免疫添加剂等方面的研究已成为很多研究者关注的热点。本实验根据NCBI/GenBank上已登录鱼类hepcidin序列信息,根据序列的保守性,用Primer 5.0软件设计一对兼并引物(F1,R1)；表达引物(F2,R2)加入酶切位点和终止密码子,在上游表达引物F2中加入EcoR I限制性内切酶酶切位点,在下游表达引物R2中加入NotⅠ限制性内切酶酶切位点。利用RT-PCR方法,从中华鲟血液cDNA文库中克隆抗菌肽hepcidin基因；利用表达引物(F2,R2)对重组质粒进行PCR扩增,目的片段与表达载体pPICZaA都经过限制性内切酶EcoR I和NotⅠ分步双酶切后,T4连接酶16℃连接过夜,转化大肠杆菌TOP10,构建真核重组表达质粒pPICZaA-hepcidin,并送华大基因公司测序鉴定。重组表达质粒pPICZaA-hepcidin通过BstXI单酶切线性化、电泳,纯化回收酶切产物。电转化感受态的毕赤酵母工程菌GS115,转化后涂布含ZeocinTM培养基,筛选具有高抗性的转化子。先用BMGY培养液(含甘油)激活培养约24 h,OD600值达2-6时,收集菌液,换BMMY培养液,在28℃,250 rpm条件下开始甲醇诱导表达。每隔24 h,向锥形瓶中加入终浓度为0.8%的甲醇,并补充适量的无菌水,同时诱导pPICZaA空载体酵母菌。72 h后收集上述甲醇诱导表达后的上清液,用饱和度为85%的硫酸铵浓缩酵母诱导菌表达上清,对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性、抑菌效价和热稳定性测定,初步判断抗菌肽hepcidin的生物活性。结果显示：1、从中华鲟血液cDNA文库中成功克隆了抗菌肽hepcidin基因,目的片段长度为327 bp；成功构建了真核重组表达载体pPICZaA-hepcidin,而且该重组表达蛋白能够体外抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和温和气单胞菌,并对耐药性菌株嗜水气单胞菌也有很好的杀菌效果,但是对枯草芽孢杆菌抑菌效果不明显,对迟缓爱德华氏菌没有抑菌作用。说明本研究成功在毕赤酵母中表达出具有生物活性的hepcidin重组蛋白。2、抑菌结果显示,加入70μL重组抗菌肽hepcidin就可以抑制260μL LB培养基中含有40μL大肠杆菌DH5α的生长,与1μg氨苄青霉素的抑菌效果相当。3、重组抗菌肽hepcidin的热稳定性测定结果显示,重组抗菌肽hepcidin煮沸10min和30 min均有抗菌活性,但是相比未煮沸的重组抗菌肽hepcidin,抗菌活性有所降低；煮沸1 h,重组抗菌肽hepcidin失去抗菌活性。表明该蛋白在预防和治疗鲟科鱼类细菌性疾病方面有潜在的应用价值,诱导表达出具有活性的抗菌肽,并为抗菌肽的应用研究及其大规模生产奠定了基础。