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研究目的:巨噬细胞受所处微环境的影响,朝着不同方向进行活化,即为巨噬细胞极化。现有大量研究表明,巨噬细胞主要活化成M1表型及M2表型,其发挥不同的功能且与多种疾病相关。巨噬细胞极化相关的机制较为复杂,仍有待研究。青藤碱为生物碱类化合物,具有抗炎镇痛、抗肿瘤、免疫抑制等多种药理作用。本实验室前期结果显示,青藤碱抑制由LPS诱导的巨噬细胞M1极化,也能抑制IL-4诱导的巨噬细胞M2极化。在体内外实验结果中证明,青藤碱调节α7nAChR表达,同时α7nAChR是青藤碱发挥抗炎作用的重要靶标。基于此,本实验将探讨青藤碱调节巨噬细胞极化与α7nAChR之间的联系。本实验首先明确青藤碱对LPS诱导的巨噬细胞M1极化及α7nAChR表达水平的影响,分析α7nAChR表达与M1极化的相关性,进一步构建α7nAChR基因沉默的细胞模型,观察沉默α7nAChR对M1极化的影响。另一方面,本实验比较IL-4与IL-4/6诱导的巨噬细胞M2极化指标表达水平及α7nAChR蛋白表达水平的变化,观察青藤碱对M2极化及α7nAChR蛋白表达水平的影响,并考察沉默α7nAChR对M2极化的影响。综合从以上方面分析α7nAChR对巨噬细胞极化的影响,为阐明青藤碱作用于α7nAChR调节巨噬细胞极化的作用机制提供依据。研究方法:1.α7nAChR在M1极化中的作用及青藤碱的影响1.1青藤碱对M1极化及α7nAChR表达的影响采用LPS诱导RAW 264.7细胞,建立M1极化模型,给予青藤碱,采用ELISA法观察细胞上清液中TNF-α的分泌量;利用RT-qPCR法观察iNOS、IL-6 mRNA表达水平的变化;Western Blot方法检测α7nAChR蛋白表达水平。1.2构建α7nAChR基因沉默的巨噬细胞模型本实验采用慢病毒转染技术,通过摸索慢病毒转染的最佳条件,利用慢病毒结构的抗生素抗性,选用嘌呤霉素筛选稳定株,以此构建α7nAChR基因沉默的细胞模型;通过Western Blot方法鉴定α7nAChR基因的沉默效果。1.3沉默α7nAChR对巨噬细胞增殖的影响采用CCK-8法检测经阴性对照病毒（Negative Control）转染的细胞与含α7nAChR shRNA慢病毒转染的细胞,两者分别在不同细胞接种浓度下于种板后24h、48h、72h、96h的吸光度值,以此探讨α7nAChR基因的沉默对细胞增殖的影响。1.4沉默α7nAChR对巨噬细胞M1极化的影响采用ELISA法检测上述两种细胞在给予LPS刺激的不同时间点下TNF-α分泌量的变化,探讨沉默α7nAChR对炎症因子表达水平的影响及其时间变化规律。同时利用RT-qPCR法检测上述两种细胞在给予LPS刺激后的24h时TNF-α、IL-6、iNOS mRNA的表达水平,以此阐述沉默α7nAChR对巨噬细胞M1极化的影响。2.α7nAChR在M2极化中的作用及青藤碱的影响2.1摸索IL-4诱导的巨噬细胞M2极化的作用时间及青藤碱、烟碱的剂量采用ELISA法检测IL-4在不同时间点下对RAW 264.7细胞IL-10分泌量的影响,给予10ng/mL的IL-4,收集在IL-4刺激后的12h、24h、36h、48h细胞上清液中IL-10的分泌量,以此明确IL-4的诱导时间。后续观察不同浓度的青藤碱、烟碱对IL-4诱导的RAW 264.7细胞IL-10的分泌量,以此确定青藤碱、烟碱的给药剂量。2.2比较IL-4与IL-4/6诱导的巨噬细胞M2极化及α7nAChR蛋白表达的影响分别采用RT-qPCR法及ELISA法检测给予IL-4、IL-6、IL-4/6后巨噬细胞M2极化指标Arg-1、IL-10、Fizz1、Ym1表达水平的变化,比较IL-4与IL-4/6两种M2极化模型下M2极化相关指标表达水平的变化;并采用Western Blot法检测IL-4、IL-4/6诱导的巨噬细胞α7nAChR表达水平,初步探讨α7nAChR与M2极化的联系。2.3青藤碱对巨噬细胞的M2极化及α7nAChR表达水平的影响以烟碱作为阳性对照药物,分别采用RT-qPCR、ELISA法观察青藤碱对单一 IL-4刺激与IL-4/6诱导的巨噬细胞的Arg-1 mRNA、IL-10分泌量;并采用Western Blot法观察青藤碱对IL-4/6诱导的巨噬细胞α7nAChR表达水平的影响,以此探讨青藤碱是否作用于α7nAChR影响巨噬细胞M2极化。2.4沉默α7nAChR对巨噬细胞M2极化的影响采用 RT-qPCR法检测 Negative Control 细胞与 α7nAChR shRNA 细胞在 IL-4/6诱导下M2极化指标Arg-1、Fizz1、Ym1 mRNA表达水平,以此探讨α7nAChR与M2极化的联系。研究结果:1.α7nAChR在M1极化中的作用及青藤碱的影响1.1青藤碱对M1极化及α7nAChR表达的影响实验结果表明,与对照组相比,LPS组的TNF-α的分泌量及iNOS、IL-6mRNA表达水平均显著升高;而给予青藤碱后,与LPS组相比,上述指标均显著下调。同时,青藤碱能显著抑制LPS诱导的α7nAChR表达上调。1.2构建α7nAChR基因沉默的巨噬细胞模型采用慢病毒转染RAW 264.7细胞,选择MOI=200、100、50、20、10的条件,同时设置4种不同的培养条件:空白对照组、常规培养基组、助感染剂A液组与助感染剂P液组,观察转染后72h的荧光表达情况,确定使用MOI=100联合助感染剂P液作为慢病毒转染条件。通过CCK-8法检测不同浓度的嘌呤霉素对细胞的增殖作用,观察给药后24h、48h、72h的OD值变化,嘌呤霉素2μg/mL组中,48h的细胞存活率为5.02%,72h的细胞存活率为3.15%;嘌呤霉素5μg/mL组中,48h的细胞存活率为1.80%,72h的细胞存活率为0.56%。故后续实验选择2μg/mL的嘌呤霉素作为初次筛选稳定株的浓度。利用Western Blot法确定α7nAChR基因沉默的细胞中α7nAChR表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组比较,α7nAChR基因沉默组细胞的α7nAChR表达被抑制,提示α7nAChR基因沉默的细胞模型已成功构建。1.3沉默α7nAChR对巨噬细胞增殖的影响利用CCK-8法检测阴性对照组与α7nAChR基因沉默组细胞在不同细胞接种浓度下于24h、48h、72h、96h时细胞增殖情况。结果显示,当细胞处于对数生长期时,阴性对照组细胞的细胞增殖活力高于沉默组细胞。1.4沉默α7nAChR对巨噬细胞M1极化的影响采用ELIS A法检测给予LPS的不同时间点下α7nAChR基因沉默细胞的TNF-α分泌量,结果显示,与阴性对照组细胞的LPS组相比,在不同时间点下,α7nAChR基因沉默组细胞LPS组的TNF-α分泌量均显著下调。同时采用RT-qPCR法检测给予LPS刺激24h对Negative Control细胞与α7nAChR shRNA细胞的TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表达水平,结果显示,与Negative Control细胞的LPS组相比,α7nAChR shRNA细胞的LPS组的TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表达水平均显著下调。2.α7nAChR在M2极化中的作用及青藤碱的影响2.1摸索IL-4诱导的巨噬细胞M2极化的作用时间及青藤碱、烟碱的剂量利用ELISA法检测IL-4在不同时间点下对RAW 264.7细胞的IL-10分泌量的影响,确定IL-4的剂量为10ng/mL,诱导时间均为24h。采用ELISA法检测青藤碱与烟碱对IL-4诱导的RAW 264.7细胞的IL-10分泌量的影响,结果显示,与IL-4组相比,青藤碱的剂量在200μM、400μM、800μM、1000μM下均能显著抑制由IL-4诱导的细胞的IL-10分泌量的上调,且呈剂量依赖关系。后续实验中青藤碱浓度将选用400μM;而烟碱仅在400μM的剂量下有作用,其能显著抑制IL-10的分泌量,故后续选用烟碱400μM。2.2比较IL-4与IL-4/6诱导的巨噬细胞M2极化及α7nAChR蛋白表达的影响比较单一 IL-4刺激与IL-4/6双重刺激对巨噬细胞M2极化的影响,结果表明,与 IL-4 组相比,IL-4/6 组的 Arg-1、Fizz1、Ym1 mRNA、IL-10 分泌量表达水平均显著增加。同时采用Western Blot法观察IL-4与IL-4/6诱导下巨噬细胞α7nAChR蛋白表达水平的变化。结果显示,与con组相比,IL-4组的α7nAChR蛋白表达水平无显著差异,而IL-4/6组的α7nAChR蛋白表达水平则显著上调;与IL-4组相比,IL-4/6组的α7nAChR蛋白表达水平显著上调。2.3青藤碱对巨噬细胞的M2极化及α7nAChR表达水平的影响观察青藤碱、烟碱对IL-4与IL-4/6诱导的巨噬细胞的M2极化指标的影响,结果显示,青藤碱或烟碱均能显著下调两种M2极化模型中IL-10及Arg-1表达上调情况。同时观察青藤碱或烟碱对IL-4/6诱导的巨噬细胞的α7nAChR表达水平,结果显示,与对照组相比,IL-4/6组的α7nAChR表达水平显著增加;与IL-4/6组相比,给予青藤碱或烟碱均能显著下调α7nAChR表达水平。2.4沉默α7nAChR对巨噬细胞M2极化的影响采用 RT-qPCR法检测 Negative Control 细胞与 α7nAChR shRNA 细胞在 IL-4/6诱导下M2极化指标Arg-1、Fizz1、Ym1 mRNA表达水平,结果显示,与Negative Control 细胞的 IL-4/6 组相比,α7nAChR shRNA 细胞的 IL-4/6 组的 Arg-1、Fizz1、Ym1 mRNA表达水平显著上调。结论:1.青藤碱能抑制巨噬细胞的M1极化进程,并下调α7nAChR表达,作用与烟碱类似。2.α7nAChR参与巨噬细胞M1极化;沉默α7nAChR能抑制巨噬细胞的M1极化过程,提示青藤碱均能通过下调α7nAChR表达抑制巨噬细胞的M1极化。3.青藤碱能抑制巨噬细胞的M2极化进程。4.在巨噬细胞的M2极化模型中,单独给予IL-4诱导巨噬细胞M2极化时,其α7nAChR表达无明显变化;而在IL-4和IL-6联合诱导下,其α7nAChR表达升高,给予青藤碱后则下调α7nAChR的表达。5.沉默α7nAChR表达,能显著促进巨噬细胞M2极化过程。但在M2极化时青藤碱的调节作用则较为复杂。6.在巨噬细胞M1极化中,青藤碱通过调节α7nAChR的表达从而调节巨噬细胞的M1极化,下调α7nAChR表达能抑制M1极化,并促进其向M2表型方向转变。