背景和目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染形成乙型病毒性肝炎(hepatitis B,HB),是危及全球人类健康的一种世界性传染病。HB或HBV相关肝病进展成肝癌的机制至今尚未完全清楚。肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)是世界发生率最高的恶性肿瘤之一,乙肝病毒x基因(hepatitis B virus X gene, HBx)及其编码产物(hepatitis B virus X antigene, HBxAg),被认为在肝癌的发生发展过程中扮演着重要角色。在调节肿瘤血管生成方而,不同血管生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及受体(VEGFR)发挥核心作用,而VEGFR3的作用有其独特性,它在发育的不同阶段发挥不同的作用。在本课题前期研究中,导师童光东教授已通过基础研究初步证实了HBV可能通过HBxAg影响肝癌的生成和发展,此后通过对乙肝相关肝癌癌前病变的研究,获得一系列早期癌变标志物,并发现早期癌变标志物之一VEGFR3可能与HBx存在一定相关性,从而提出了HBx可能影响肝癌VEGFR3表达的假说。同时,前期研究通过采用复方叶下珠(compound phyllanthus urinaria L.,CP)对人肝癌细胞动物模型及肝癌患者进行干预,结果表明CP具有直接抗HBxAg表达而抑制肝癌进展的作用。在此基础上,本研究设计建立稳定转染HBx和VEGFR3基因的肝癌细胞株,通过制作相关动物模型,并用中药叶下珠水提物(the aqueous extract of phyllanthus urinaria L.,AEP)进行处理；同时采用CP干预肝癌癌前病变患者,旨在进一步探讨HBx和VEGFR3在HB相关肝癌中的相关性及对肿瘤调节的机制,了解AEP及其复方(CP)对HB相关肝癌和癌前病变的作用机理,从而为进一步开发中药抗癌药物,及扩大临床推广应用提供证据支持。方法：1、首先构建转染HBx和VEGFR3的人肝癌HepG2稳定细胞株；PCR技术分别从HBV全基因组、人cDNA中扩增HBx和VEGFR3片段；将HBx和VEGFR3分别克隆至逆转录病毒载体质粒pBaBe-puro,构建重组质粒pBaBe-puro-HBx、 pBaBe-puro-VEGFR3,重组质粒与PIK包装质粒共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装产生重组逆转录病毒后,感染人肝癌细胞HepG2,获得转入HBx或VEGFR3的HepG2细胞。收集HepG2-HBx、HepG2-CAT、HepG2-VEGFR3细胞,用酶联免疫检测仪检测不同细胞增殖时间各细胞吸光度,通过流式细胞仪观察细胞周期；并收集各细胞RNA及蛋白质,进行RT-QPCR及western blot等检测,进一步验证HBx及VEGFR3在这些细胞中的表达情况。2、制作叶下株水提取物(AEP)和复方叶下珠制剂(复方叶下珠(CP),组成：叶下珠30g、半枝莲30g、莪术15g、黄芪30g、山慈菇10g,由广东一方制药有限公司提供颗粒剂)。3、制作裸鼠颈部皮下移植瘤模型；选用Balb/c nu小鼠。4、动物管理：SPF饲养环境。4、分组：(1)动物实验：按SPSS17.0的随机数字法按动物编号进行完全随机排序,完成分组,每组6只,分别为：G1,生理盐水对照组、G2,HepG2-HBx细胞空白对照组、G3,HepG2-HBx细胞CTX治疗组、G4,HepG2-HBx细胞AEP治疗组、G5,HepG2-CAT细胞空白对照组、G6,HepG2-CAT细胞CTX治疗组、G7,HepG2-CAT细胞AEP治疗组、G8,HepG2-VEGFR3细胞空白对照组、G9,HepG2-VEGFR3细胞CTX治疗组、G10,HepG2-VEGFR3细胞AEP治疗组。分别予NS、NS、CTX、AEP、NS、 CTX、AEP、NS、CTX、AEP。AEP灌胃6次/周、NS用法同AEP、CTX腹腔注射5次/周。按CTX使用疗程：共使用30次(1疗程),疗程结束时采集标本。(2)临床试验：筛选有癌前病变指征的肝硬化病例113例,实验组59例,对照组54例。入组前签署知情同意书。实验组采用CP口服,对照组不治疗。两组患者仅在肝功能异常是采用常规护肝治疗。5、取材：(1)动物：称量体重、常规摘眼球方法取血、颈椎脱臼法处死、取肿瘤、肝脏等。(2)患者：在治疗前、治疗12月、24月时分别抽取患者血清送检。6、观察指标及检测：动物：观察组织形态学：分别观察实验动物体重；瘤体大小、质量、形态等。生长曲线图绘制。常规HE染色。ELISA法测AFP水平。IHC检测HBx、VEGFR3表达。Western blot检测HBx、VEGFR3表达。患者：观察患者生存质量,检测血清VEGFR3等癌前病变标志物指标。7、统计学处理：运用SPSS17.0统计软件。两两比较用t检验。计数资料用卡方检验。计量资料组间比较用方差分析(单因素、多因素方差分析)。等级资料采用非参数检验。重复数据用可得复测量数据的方差分析。变量依存关系用回归分析。假设检验：P<0.05为有统计学意义。结果：1、成功克隆出HBx和VEGFR3基因,并经序列分析证实;获得重组逆转录病毒质粒pBaBe-puro-HBx、pBaBe-puro-VEGFR3;建立了携带HBx、VEGFR3的HepG2细胞；分别经RT-PCR及Western blot检测稳定表达。2、获得叶下株水提取物、叶下株水提物最大无毒剂量为15m/mL。3、不同组动物体重增长和时间存在交互作用(P<0.05);4、移植瘤质量：(1)转染HepG2-HBx各组中对照组(G2)肿瘤生长最快,AEP组(G4)肿瘤生长最慢,经SNK法检验(表5),三组间均有统计学意义(p<0.05),且AEP组抑制作用较CTX组作用更强(P<0.05)。转染HepG2-CAT各组中,AEP组(G7)和CTX组(G6)肿瘤质量均低于对照组(P<0.05),但AEP组与CTX组之间无统计学差异(P>0.05)。转染HepG2-VEGFR3各组中,AEP组(G10)和CTX组(G9)肿瘤质量均低于对照组(P<0.05),但AEP组与CTX组之间无统计学差异(P>0.05)。(2)按NS、CTX及AEP不同处理因素分组,不同接种细胞组间比较均无统计学意义(P>0.05)。5、采用ELISA方法检测裸鼠血清AFP水平,AFP最小值1.27ng/mL,最大值24.01ng/mL,均数为3.7439±5.20ng/mL(mean±SD)。经Homogeneity方差齐性检验,Levene统计值为4.908,P=0.000,方差不齐；经非参数检验,F=3.772,P=0.062,各组之间无统计学意义。采用ELISA方法检测裸鼠血清VEGFR3水平,经Homogeneity方差齐性检验,Levene统计值为1.436,P=0.217,方差齐；经单因素方差分析,F=1.018,P=0.448,各组之间无统计学意义(P>0.05)。6、瘤组织HBx表达IHC检测：HBx表达IHC检测G2组表达最强,G3组阳性信号较弱、G4组表达最弱。组间两两比较结果：G2组和G3组、G2组和G4组之间比较均有统计学差异(P<0.05),G3组与G4组相比无统计学意义(P>0.05)。提示AEP和CTX均可抑制移植瘤组织中HBx表达,但两者之间无差异。7、瘤组织HBx表达Western Blot检测：经Western Blot检测,接种HepG2-HBx细胞的模型中,AEP组HBx表达最少,但与CTX组相比无统计学意义(P>0.05),AEP组和CTX组与NS组相比均有统计学意义(P<0.05)。表明AEP和CTX均具有抑制肿瘤细胞中HBx表达的作用,但二者之间无统计学差异。8、瘤组织VEGFR3表达IHC检测结果示：模型对照组中转染HBx基因(G2组)和VEGFR3基因(G8组)的组别阳性细胞染色率均在75%以上,其中G8组(图3.6-G8)表达最强,但与G2组相比无统计学意义(P>0.05),G5组表达最低。G3组表达低于G4、G6组(P<0.05),也低于G9组(P<0.05),G9组低于G8组(P<0.05),但与G10组比较无统计学意义(P>0.05)。9、瘤组织VEGFR3表达Western Blot检测(1)接种同一细胞株的不同处理组比较：AEP组VEGFR3表达最低,与CTX组比较无统计学差异(P>0.05),NS组表达最高。AEP组和CTX组与NS组相比均有统计学差异(P<0.05)。(2)接受同一处理的不同接种细胞组比较接受NS处理的不同模型组比较：接种HepG2-VEGFR3细胞组VEGFR3表达最高,但与HepG2-HBx组相比无统计学意义(P>0.05)。二组VEGFR3表达均高于接种HepG2-CAT细胞组(P<0.05)。提示HBx可能具有上调肝癌细胞中VEGFR3表达的作用。接受AEP处理的不同模型组比较：接种HepG2-VEGFR3细胞组VEGFR3表达最高,与接种HepG2-HBx细胞组相比有统计学意义(P<0.05),接种HepG2-HBx细胞组表达最低,与接种HepG2-VEGFR3细胞(P<0.01)、HepG2-CAT细胞组相比均有统计学意义(P<0.05)。表明AEP可抑制各组细胞VEGFR3表达,并明显降低HBx组VEGFR3表达。提示其抑制VEGFR3作用与HBx有一定关联。接受CTX处理的不同模型组比较：接种HepG2-VEGFR3细胞组VEGFR3表达最高,但与HepG2-HBx组相比无统计学意义(P>0.05)。二组VEGFR3表达均高于接种HepG2-CAT细胞组(P<0.05)。10、CP治疗后,实验组肝癌癌前病变患者在24月临床症状改善、肝纤三项、降低HBV-DNA水平等方面较对照组有统计学差异(P<0.05),而在12月临床症状改善、肝功能改善、HBeAg血清学转换等方面与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。在所检测的6个抗体中,抗URG11和抗VEGFR3发生率最高,两组阳性率皆在60%以上,而治疗组经过治疗后两抗体皆有下降,而对照组有所上升,比较有统计学意义(P=0.0417、P=0.0452)。观察结束时,共11例发生肝癌,其中对照组9例,治疗组2例,两组比较有统计学意义(P<0.05)。结论：1.VEGFR3在Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤组织中均有表达且与HBx表达呈正相关,二者不是独立的,HBx可介导肝癌细胞VEGFR3高表达。2.叶下珠不仅对HBx具有直接抑制作用,同时也直接抑制VEGFR3表达,还能通过抑制HBx表达间接抑制VEGFR3水平,实现对对乙肝相关性肝癌的抑制作用；同时,叶下珠对HBx阴性肝癌也有抑制作用,可能正足通过VEGFR3途径得以实现的,为进一步研究其它非乙型肝炎相关性肝癌的治疗提供了一条思路。而CTX也可直接抑制肝癌细胞中VEGFR3表达,但不通过抑制HBx表达发挥作用。叶下珠可抑制荷瘤裸鼠癌组织生长,但对动物本身体重增长无明显影响。3.通过CP对肝癌癌前病变的临床研究,表明VEGFR3在确诊肝癌及肝癌前病变患者中高表达,证实可作为肝癌癌前病变的预测因素之一；CP可抑制肝癌癌前病变患者VEGFR3表达水平，提示CP可能通过调竹VEGFR3表达等途径发挥抑制肿瘤作用。结合实验研究结论,叶下珠可能通过HBx直接或间接抑制VEGFR3表达。4.本研究中,HBx与VEGFR3及AFP水平在皮下移植瘤裸鼠血清及肝脏的表达不典型,似与临床实际有一定差异,主要原因可能为：选用了皮下移植瘤模型而不是原位癌模型；样本量的原因；或检测试剂本身及使用、人员操作等因素等,此外,成年动物血清中VEGFR3表达本身较低,故而使结果可能出现一定偏倚,存在一定的局限性。但由于本课题设计时考虑了可能的干扰因素，严格设立了对照组(阳性和阴性对照)在一定程度上消除了以上偏倚。条件许可下进一步扩大样本量并优选更接近于人体生化环境的动物模型,将更有利于提高研究结果的可靠性。以上结果和结论,为进一步探讨HBx及VEGFR3的相关性及对肝癌的防治作用提供了载体、口的细胞株等物质条件,并为乙肝病毒x基因相关肝癌发生机制提供了新的思路,同时为中药防治肿瘤的应用推广提供了证据支持,具有较大的社会价值和现实意义。为此,进一步挖掘整理相关实验结果,探索更多HBx及VEGFR3与肝癌进程中的内在关联是木课题组将着重关注的后续工作之一。此外,通过进一步纯化中药制剂,分析提炼药物有效成分；并通过优化方案设计,扩大样本量,优选动物模型等手段,将有助于进一步提高结果可靠性,并将有利于指导筛选通过HBx介导VEGFR3表达防治肝癌的中药开发和应用,这也是本课题组下一步将着力开展的工作。