【摘 要】
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目的:1.通过分析乳酸脱氢酶C4（lactate dehydrogenase C4,LDH-C4）在骨肉瘤（osteosarcoma,OS）组织中的表达情况,探讨其表达水平与骨肉瘤患者临床病理资料之间的相关性。2.利用慢病毒载体构建稳定表达LDH-C4的骨肉瘤细胞MG63,明确LDH-C4过表达对骨肉瘤细胞MG63生物学行为能力的影响,初步探讨相关分子机制。方法:1.采用免疫组织化学染色方法（IH
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目的:1.通过分析乳酸脱氢酶C4（lactate dehydrogenase C4,LDH-C4）在骨肉瘤（osteosarcoma,OS）组织中的表达情况,探讨其表达水平与骨肉瘤患者临床病理资料之间的相关性。2.利用慢病毒载体构建稳定表达LDH-C4的骨肉瘤细胞MG63,明确LDH-C4过表达对骨肉瘤细胞MG63生物学行为能力的影响,初步探讨相关分子机制。方法:1.采用免疫组织化学染色方法（IHC）对高通量骨肉瘤组织芯片进行检测,根据表达结果评分结合骨肉瘤组织芯片已建立的临床资料,分析骨肉瘤组织中LDH-C4蛋白的表达水平与骨肉瘤患者TNM分期、临床分期、肿瘤大小等临床病理参数的关系。2.构建GV492-LDHC-EGFP慢病毒过表达载体并感染骨肉瘤细胞MG63,设置LDH-C4感染组（GV492-LDHC-EGFP）、空载组（GV492-C-EGFP）和空白对照组,采用不同感染复数（MOI）和嘌呤霉素浓度筛选稳定感染的MG63细胞系。采用LDH-C4蛋白活性染色和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription qPCR,RT-qPCR）检测各组骨肉瘤细胞蛋白和LDHC mRNA表达情况。通过CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕修复实验以及Transwell细胞迁移、侵袭实验,检测LDH-C4过表达对骨肉瘤细胞MG63增殖和迁移侵袭等能力的影响。3.通过比色法检测乳酸和丙酮酸表达水平,葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量,分析LDH-C4过表达对糖代谢的能量供应模式的影响。通过Western blot实验,分析LDH-C4过表达对PI3K/AKT/mTOR信号转导通路相关蛋白表达的影响。结果:1.对高通量骨肉瘤组织芯片结果分析,发现LDH-C4蛋白主要表达于骨肉瘤细胞的细胞质中,而LDH-C4在软骨肉瘤中表达主要位于细胞核中;LDH-C4中/低表达占54.29%（38/70）;临床分期高和肿块直径大的骨肉瘤患者,LDH-C4的表达呈低水平（P<0.05）。2.骨肉瘤细胞MG63在慢病毒MOI为50,嘌呤霉素浓度为2.0μg/mL时,绿色荧光蛋白表达率达80%,筛选获得符合要求的稳定感染细胞系。LDH-C4蛋白活性染色发现感染组MG63细胞表达强阳性,同时RT-qPCR结果显示,感染组LDHC m RNA表达水平高于空载组和空白对照组（P<0.05）。CCK-8实验、平板克隆实验、细胞划痕实验和Transwell小室迁移侵袭等实验显示,感染组MG63细胞的增殖能力、克隆能力、迁移能力和侵袭能力被明显抑制。3.能量代谢实验结果显示,感染组MG63细胞葡萄糖消耗量降低,乳酸生成减少,丙酮酸生成增多。Western blot实验发现,LDH-C4过表达下调感染组PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达,而HIF-1蛋白表达无明显变化。结论:1.骨肉瘤LDH-C4的表达呈中低水平,且临床分期高和肿块直径大的骨肉瘤患者LDH-C4水平低。2.过表达LDH-C4可明显降低MG63骨肉瘤细胞体外生长增殖、克隆形成以及侵袭和迁移能力。3.在MG-63细胞中,LDH-C4过表达可抑制细胞糖酵解,降低葡萄糖消耗,以及通过负向调控PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥其生物学功能。
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