蛤蚧(壁虎科Gekkonidae壁虎属动物Gekko gecko Linnaeus)为我国传统名贵动物中药材,因其具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精的功效而广泛用于多种虚证咳喘和肾虚阳痿等症。但因市场需求增加、野生资源减少、同名异物和同物异名等情况较为严重,导致市场常有混伪品的出现,严重威胁临床用药安全。因此,为保障药源无误、药效可靠,本文采用分子鉴定方法对其进行研究,以期实现蛤蚧药材的准确鉴定。为实现蛤蚧DNA的高效提取,为其分子鉴定研究奠定基础,本研究对动物DNA提取方法中的裂解液、冲洗液进行了优化,并与试剂盒法进行对比研究。结果表明,采用本研究优化后的SDS法和DNA冲洗液,可实现1 mg蛤蚧干品肌肉组织的DNA提取和DNA条形码鉴定;取样1 mg和30 mg时,所得平均DNA浓度分别为2.72 ng/μL和139.0 ng/μL,高于试剂盒法的1.63 ng/μL和98.9 ng/μL,即该方法DNA提取效率较高,为蛤蚧样品DNA的高效提取提供了一定的技术支持。为实现蛤蚧与其混伪品的快速鉴定,并建立高效的特异微条码鉴别方法,本研究共收集蛤蚧及其19种混伪品293份,蛤蚧相关产品5种15份。经DNA提取、PCR扩增、测序验证、遗传距离分析和邻接(Neighbor Joining,NJ)树分析,基于COI序列对文中20个物种进行DNA条形码鉴定分析;并设计蛤蚧特异引物,对15份蛤蚧产品进行检测。结果显示,蛤蚧的种内最大遗传距离为0.148,远小于其种间最小遗传距离0.262;而且,在NJ树图中,蛤蚧的34条单倍型以99%的自展支持率单独聚为一支,表明蛤蚧可与混伪品准确区分。同时,19种混伪品皆可根据遗传距离分析和构建NJ树进行区分。文中共得2对特异引物 COISF2/COISR2 和 COISF3/COISR3,可分别扩增到 200 bp 和 133 bp的短片段,以实现蛤蚧与混伪品的特异鉴别。其中,特异引物COISF3/COISR3的最低检测浓度小于10 pg/μL,成功应用于15份蛤蚧产品的特异检测。因此,基于COI序列的DNA条形码技术和特异微条码鉴别方法可实现蛤蚧与混伪品的快速鉴别,并能应用于蛤蚧相关产品的特异检测,对于蛤蚧药材、蛤蚧产品的检测具有较大应用价值。为实现蛤蚧的高效鉴别和掺伪检测,并建立蛤蚧中成药等深加工产品的Bar-HRM鉴别方法,本研究基于12S rRNA序列,对蛤蚧和6种常见混伪品进行HRM鉴别和掺伪分析,并对10份市售蛤蚧粉进行Bar-HRM检测。为筛选蛤蚧与其14种混伪品的minibarcode,基于16S rRNA序列,设计特异引物,进行Bar-HRM验证分析,并对10份市售蛤蚧粉、15份蛤蚧产品进行检测。结果显示,蛤蚧与6种常见混伪品均可通过12SrRNA-HRM曲线分析进行鉴别;最低掺伪检测限为1%;基于12S rRNA序列的Bar-HRM技术可实现市售蛤蚧粉的真伪检测和质量评估。同时,基于16S rRNA序列设计出一对特异引物16SSF2/16SSR2,扩增片段为132 bp;采用该minibarcode建立了蛤蚧的Bar-HRM检测方法。该方法不仅能够实现蛤蚧与常见混伪品的鉴别,还可检测出蛤蚧产品中其它动物物种,在掺伪检测中具有独特优势,为蛤蚧相关产品的鉴别提供了 一种新方法。综上所述,本研究优化后的SDS法提高了蛤蚧的DNA提取效率,为后续分子鉴定研究奠定了基础。DNA条形码技术结合高分辨率熔解曲线技术可实现蛤蚧药材的高效鉴别,并为蛤蚧产品的检测提供了新方法,也为其它中药的鉴定研究提供了新思路,具有重要应用价值。