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目的研究2型糖尿病大鼠血管中小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)与腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)及eNOS蛋白的表达变化,通过体外高糖培养内皮细胞进一步探讨Cav-1对AMPK信号的调控关系。方法1.2型糖尿病大鼠模型的建立:6周龄雄性Wistar大鼠(体重约180~200g)15只,适应喂养1周,随机分为对照组(Control,n=5)、模型组(Model,n=5)、二甲双胍组(Met,n=5)。对照组全程给予普通饲料喂养,模型组和二甲双胍组始终给予高脂高糖饲料喂养,7周后腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ 40 mg/kg),3天后检测空腹血糖,连续两次空腹血糖≥16.7mmol/L提示2型糖尿病模型成功。模型成功后,二甲双胍组开始给予二甲双胍(Metformin,Met,200mg/kg/d)灌胃,每天一次,共4周,每周检测大鼠体重、空腹血糖。实验结束后,检测血清中相关生化指标。2.腹主动脉苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE):观察大鼠腹主动脉血管形态变化。3.腹主动脉免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测:检测Cav-1、AMPK蛋白在大鼠腹主动脉中表达及分布。4.免疫印迹法(Western Blot)检测:实验结束后,分离大鼠腹主动脉,提取蛋白,免疫印迹法检Cav-1、AMPK蛋白和eNOS蛋白表达水平。5.体外细胞实验:体外实验培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs),待细胞传代2~3代,进行实验。给予含葡萄糖培养液培养内皮细胞24~48h,细胞生长数达到70%~80%,随机分为对照组、高糖组(HG)、二甲双胍组(Met),分别给予si-RNA-Cav-1蛋白干扰处理6h,时间结束后,后更换不同葡萄糖浓度的培养液,而二甲双胍组给予含药物葡萄糖混合培养液培养,培养48h后,提取蛋白,采用免疫印迹(Western Blot)技术检测Cav-1、AMPK、eNOS蛋白表达量。结果1.各组大鼠的一般特点:各组大鼠的体重:模型组和二甲双胍组高糖高脂饲料喂养,第14周末时,与对照组比较,模型组和二甲双胍组体重分别增加16.7%和15.6%,差异有统计学意义(p<0.001);二甲双胍组与模型组比较体重差异无统计学意义(p=0.6135)。造模成功后,模型组和二甲双胍组的体重较前降低,18周末(实验结束)检测各组大鼠体重,与对照组比较,模型组和二甲双胍组大鼠体重分别降低了6.9%和4.3%,差异有统计学意义(p<0.001,p=0.013);二甲双胍组比模型组增高了2.8%,差异有统计学意义(p=0.006)。第14周末,与对照组比较,模型组和二甲双胍组空腹血糖差异无统计学意义(p>0.05)。注射STZ后,模型组和二甲双胍组血糖开始升高,与对照组比较,模型组的空腹血糖在时间点15w、16w、17w、18w明显升高,分别增加了228.1%、278.14%、214.5%和230.06%,差异有统计学意义(p<0.001)。二甲双胍组的空腹血糖与对照比较分别增加了275.7%、225.5%、181.6%和180.0%,差异有统计学意义(p<0.001);而与模型组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。采用Pearson相关分析大鼠的体重与空腹血糖的关系:各组大鼠喂养14周后,在第14末时检测各组大鼠体重与空腹血糖无相关性(r=-0.0849,p=0.7634)。注射STZ后,模型组和二甲双胍组大鼠血糖开始升高,体重较前逐渐降低,第18周末时检测各组大鼠的体重与空腹血糖呈负相关关系(r=-0.7829,p<0.001)。18周龄末大鼠血清中血糖血脂的变化:与对照组比较,模型组空腹血糖(FBG)增加了374.99%,甘油三脂(TG)增加了276.13%,总胆固醇(TC)增加了107.44%,高密度脂蛋白(HDL)增加了102.43%,极低密度脂蛋白(VLDL)增加了277.5%,糖化血红蛋白(HbA1C)增加了110.6%,差异有统计学意义(p<0.001);而二甲双胍组中FBG增加了346.89%,TG增加了133.52%,TC增加了52.43%,HDL增加了50.3%,VLDL增加了132.5%,HbA1C增加了96.7%,差异有统计学意义(p<0.01);与模型组比较,二甲双胍组FBG降低5.9%,TG降低了37.9%,VLDL降低了38.4%,HbA1C降低了6.6%,差异无统计学意义(p>0.05);TC降低了26.5%,HDL降低了25.72%,差异有统计学意义(p<0.05)。2.血管形态学变化:18周末实验结束,取腹主动脉HE染色,对照组血管内皮细胞排列均匀整齐,细胞核形态规整,血管内弹性膜结构完整,层次清晰,呈波浪状,模型组血管内皮细胞下增厚,内皮细胞缺损、排列不整齐,细胞核形状不规则,内弹性膜结构不规则,层次不清,二甲双胍组较模型组内皮细胞较前好转。免疫组化可见Cav-1阳性表达,位于胞膜,AMPK蛋白阳性表达,位于胞质内。3.大鼠血管中各蛋白的表达:采用免疫印迹法检测腹主动脉组织中Cav-1蛋白表达:与对照组比较,模型组Cav-1蛋白表达降低了44%,差异有统计学意义(p<0.001),二甲双胍治疗后,Cav-1蛋白表达明显增加,与模型组比较增加了70.14%,差异有统计学意义(p<0.001),与对照组比较,二甲双胍组的Cav-1蛋白表达降低了4.79%,差异无统计学意义(p=0.563),AMPK(Thr172)蛋白表达:与对照组相比,模型组AMPK蛋白表达降低了39.34%,差异有统计学意义(p=0.002),二甲双胍组的AMPK蛋白表达与对照组比较,增加了31.36%,与模型组比较增加了116.56%,差异有统计学意义(p=0.046,p=0.001)。eNOS蛋白表达:与对照组相比,模型组eNOS蛋白表达降低了36.78%,差异有统计学意义(p<0.001),二甲双胍组降低了21.55%,差异有统计学意义(p<0.05),与模型组比较,二甲双胍组的蛋白表达增加了24.09%,差异无统计学意义(p<0.05)。4.采用Pearson相关分析Cav-1、AMPK、eNOS蛋白与糖脂相关性分析:组织中的Cav-1与空腹血糖(r=-0.5487,p=0.0341)、甘油三脂(r=-0.5885,p=0.0210)、总胆固醇(r=-0.7426,p=0.0015),均呈负相关关系。AMPK蛋白表达与空腹血糖(r=-0.5214,p=0.0462)、甘油三脂(r=-0.6333,p=0.0113)、总胆固醇(r=-0.7207,p=0.0024),均呈负相关关系;eNOS蛋白表达与空腹血糖(r=-0.5865,p=0.0216)、甘油三脂(r=-0.5885,p=0.0210)、总胆固醇(r=-0.7426,p=0.0015)呈负相关关系。蛋白表达间相关关系:各组大鼠腹主动脉组织中Cav-1的表达与AMPK蛋白表达呈正相关关系(r=0.7670,p<0.001);与eNOS蛋白表达无明显相关性(r=0.3671,p=0.1783);AMPK蛋白与eNOS蛋白的表达呈正相关关系(r=0.7670,p<0.001)。5.细胞中蛋白表达量:(1)Cav-1蛋白表达:与对照组比较,高糖组中Cav-1的表达降低了9.5%,差异有统计学意义(p=0.011),二甲双胍组中增加了24.4%,差异有统计学意义(p=0.016);但二甲双胍组与高糖组比较增加了37.6%,差异有统计学意义(p=0.005)。AMPK蛋白表达:与对照组比较,高糖组和二甲双胍组的蛋白表达分别降低了31.7%和19.8%,差异有统计学意义(p<0.001,p=0.0159);给予二甲双胍治疗后,二甲双胍组的AMPK蛋白表达比高糖组增加了14.9%,差异无统计学意义(p=0.088)。eNOS蛋白表达:与对照组比较,高糖组的蛋白表达降低了25.2%,差异有统计学意义(p<0.001),给予二甲双胍治疗后,二甲双胍组的eNOS蛋白表达比高糖组增加了17.5%,差异无统计学意义(p>0.05)(2)Cav-1蛋白沉默:与阴性干扰(si-NC+高糖组)比较,干扰后(si-Cav-1+高糖组)中Cav-1蛋白表达降低了34.7%,差异有统计学意义(p=0.001),而AMPK蛋白和eNOS蛋白表达分别降低了56.0%和24.4%,差异有统计学意义(p<0.05)。Cav-1蛋白沉默后给予二甲双胍治疗后,与阴性干扰(si-NC+二甲双胍组)比较,干扰后(si-Cav-1+二甲双胍组)中的Cav-1蛋白表达降低了49.59%,差异有统计学意义(p<0.05),AMPK蛋白和eNOS蛋白表达分别也降低了42.4%和21.1%,差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.2型糖尿病状态下,血管中Cav-1表达降低可能下调AMPK介导的糖脂代谢信号通路及下游eNOS蛋白信号途径,导致糖脂代谢紊乱、血管内皮结构异常。2.Cav-1表达降低可下调AMPK蛋白表达,影响AMPK介导的下游信号传导通路,内皮细胞功能紊乱。