研究背景器官移植是治疗许多终末期疾病和恶性肿瘤等疾病的有效办法,但是器官移植后必需应用免疫抑制剂防止急性排斥反应的发生,免疫抑制剂通过抑制T细胞和B细胞等靶细胞的细胞增殖、细胞因子合成而起作用。自环孢素和新型免疫抑制剂广泛应用于临床以来,器官移植存活率已经有了提高,但排斥反应依然是导致移植器官功能不全以至丢失的重要原囚,此外长期免疫抑制治疗的副作用,如心血管疾病、机会感染、恶性肿瘤、药物的肝肾毒性,也极大阻碍患者的长期存活。因此,建立可靠的免疫监测方法,不仅能够帮助医生根据移植受者不同的免疫应答状态合理地调整免疫抑制方案,而且可为临床移植免疫耐受的诱导提供必要条件。但是目前仍然无法区分移植抗原引起的免疫排斥反应和病毒细菌感染引起的免疫反应。理想的免疫抑制治疗应该在免疫抑制和保持免疫力间取得平衡,因此对于临床医生来说移植患者管理是一件很困难的事。保存受体免疫力,尽可能减小免疫抑制剂用量或诱导免疫耐受一直是移植免疫学家的主要目标,这方面虽然也取得了一些令人兴奋的成果,但是诱导耐受仍然有大量的工作要做,研究诱导免疫耐受方法,尽可能减小免疫抑制的用量,研究检测免疫耐受及免疫力的免疫学方法将是今后几年器官移植所面临的最重要的挑战。移植后受体的可靠的免疫状态指标可以为免疫抑制剂的使用提供依据,使免疫抑制剂不仅可以根据排斥反应的程度或耐受情况使用,还可以根据患者的易感性规范化用药,由于长期免疫抑制剂治疗所引起的的高发病率和高死亡率,高度期望规范化用药能够实现。目前,人们围绕着免疫反应发生、发展过程中所涉及的细胞及分子,提出了一系列监测指标,包括：细胞介导的淋巴淋巴细胞毒试验(Cell-mediated lymphotoxicity),外周血中白细胞介素(interleukin, IL)2、-4、-10、 γ干扰素、TNF-α、sCD30等细胞因子的检测,受体血内的供体特异性抗体的检测,T细胞对抗原非特异性多克隆刺激物反应的检测(T cell responses to polyclonal, non-antigen-specific stimulation),调节性T细胞(Treg)的监测,血液中细胞因子的：mRNA前体分析,以及采用蛋白质组学的方法寻找血液或者尿液或支气管肺泡灌洗液中与移植排斥有关的生物标记物,均从不同侧面反映着机体的免疫水平以及对移植物的排斥情况,但是,由于免疫反应的复杂性,目前的免疫学检测方法均有其局限性,各有其优点和缺点,甚至有时候得出矛盾的结果,不能很好地区分出移植耐受和移植排斥反应,因此依靠单一免疫指标来评估机体的免疫状态不太现实,临床上衡量器官移植后排斥反应及免疫抑制治疗的效能主要通过排斥反应的发生情况(病理活检)和移植物功能情况,如肾移植时血肌酐和尿素氮值,肝移植时肝功能情况(血氨、ALT、AST、胆红素等)来进行评估。但是,仅根据临床症状和病理活检还是远远不够的,因为临床症状发生时移植物排斥已较严重,不适合早期诊断；而且活组织病理检查对移植物和宿主均是一种损伤性检查,不能反复进行。本课题设计了一种简单的体内试验方法来监测皮肤移植后新西兰大白兔的免疫状态,其启发源于淋巴细胞毒性试验在体内的应用,方法为用活细胞染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester, CFDA-SE,也简称为CFSE)标记移植复合抗原供体细胞,标记的脾细胞悬液输注给不同的受体,输注后不同时间点采血进行流式细胞分析。流式细胞仪检测供体淋巴细胞在受体内遭受排斥反应过程,同时设置同基因受体细胞作为内参照,消除系统误差,在单细胞水平判定受体的免疫状态,以期为同种异体移植受体免疫状态的监测提供一种简单有效的方法。目的：建立一种能检测皮肤移植后大白兔的免疫状态的供体抗原特异性体内细胞毒性试验方法,了解体内细胞毒性实验的抗原特异性,移植排斥模型理论上具有抗原特异性,仅对供体复合抗原有特异性排斥反应。方法：建立A组：异体皮肤移植排斥模型组；D组：低剂量免疫抑制剂异体皮肤移植排斥模型组；E组：高剂量免疫抑制剂异体皮肤移植排斥模型组,分别输将供体(雌性新西兰大白兔)及受体(雄性新西兰大白兔)脾脏,流式细胞检测两种混合细胞悬液比例变化情况,同时设置B组自体皮肤移植模型组,C组：未行皮肤移植对照组,与皮肤排斥模型组进行对比研究。以上各组皮肤移植排斥模型建立后,从以上各组中分别取雌性新西兰大白兔(供体)及雄性新西兰大白兔(受体)脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度CFSE染色(雌性新西兰大白兔用高浓度6μM,雄性新西兰大白兔用低浓度0.24μM染色)后制备1：1混合细胞悬液,混合悬液制备成功后立即注入雄性新西兰大白兔(受体)体内,混合悬液注射后分别于1h、2h、4h、8h抽取外周血,用红细胞裂解液将红细胞裂解后,流式细胞仪检测小鼠外周血两种荧光细胞的比例变化,并计算各组雌性新西兰大白兔(受体)脾细胞的杀伤率(按公式计算供体特异性细胞杀伤率：%specific lysis=1-donor cells/recipient cells×100%),与移植皮片状态及常规病理检查进行对比研究。结果：1、雌兔→雄兔异体移植排斥组：皮肤移植排斥模型在移植后第9天皮肤开始脱落,13.0±1.0天时移植排斥模型移植皮肤完全排斥,移植皮肤坏死。雄兔自体皮肤移植模型：移植皮肤未出现排斥现象,移植物可以长期存活。雌兔→雄兔异体移植低剂量免疫抑制剂组：可见移植皮肤在两周左右逐渐变黑,出现坏死的迹象,皮肤存活时间为13.4±1.1天。雌兔→雄兔异体移植高剂量免疫抑制剂组：移植后14天可见移植皮肤存活,移植皮肤存活时间大于25天。2、各组皮肤移植病理结果示：A组(移植排斥组)与D组(免疫抑制剂低剂量组),移植皮肤均出现坏死,均可见皮肤结构破坏,大量淋巴细胞浸润；B组(自体移植耐受组)与E组(免疫抑制剂高剂量组)皮肤均存活,未出现移植皮肤坏死的病理表现,可见皮肤结构正常,无淋巴细胞浸润。3、皮肤移植排斥模型组和低剂量免疫抑制剂组注射混合脾细胞悬液后杀伤率在8h达到高水平86.19±6.95%和88.14±4.21%,在8小时异基因供体雄兔脾细胞基本被完全清除,而其余各组杀伤率在8小时仍处于较低的水平,自体移植耐受组8小时杀伤率为31.58±3.41%,未移植组8小时杀伤率为33.51±3.49%,异体皮肤移植高剂量免疫抑制剂组8小时杀伤率为26.82±3.26%。各时间点杀伤率进行单向方差分析结果显示：各时间点杀伤率进行单向方差分析结果显示：各时间点间杀伤率均有显著差异,1小时各组杀伤率有显著差异,F=226.53,P=0.000：2小时各组杀伤率有显著差异,F=218.37,P=0.000；4小时各组杀伤率有显著差异,F=340.11,P=0.000；8小时各组杀伤率有显著差异,F=240.07, P=0.000。Dunnett t(2-sided)法检验,各组与A组(异体移植排斥组)两两比较显示：各时间点A组与B组、C组、E组之间有显著性差异,A组与D组之间无显著性差异。即未移植组、自体移植组、高剂量免疫抑制剂组杀伤率上升缓慢,无特异性杀伤。可见各组杀伤率与移植皮肤状态及病理改变一致。结论：体内细胞毒性实验是一种供体抗原特异性免疫状态检测方法,本实验提供了一种特异的体内免疫状态监测方法,利用一种简单的将供体细胞及受体细胞经过CFSE染色后输入受体细胞体内的方法监测供、受体两种细胞的比例,将试验流式检测设定在淋巴细胞门,两种细胞CFSE的染色浓度差控制在25倍,输注细胞总数在109时,能在输注混合细胞悬液后快速准确地检测出受体的免疫状态,从而可以判断出受体的免疫系统对移植物排斥反应的强度。