云锦杜鹃转录组分析、SSR标记开发及多倍体诱导

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云锦杜鹃(Rhododendron fortunei)属杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron),是中国特有的杜鹃花属物种,主要分布于安徽、湖南、湖北、浙江等南方省份。云锦杜鹃花朵美丽,颜色鲜艳,易于人工栽培,具有较高的园艺价值。本研究以云锦杜鹃无性系ZL-01组培苗,进行转录组的测序,转录组组装后利用公共数据库对Unigene进行功能注释;采用MISA软件对云锦杜鹃Unigene进行SSR分析,明确了云锦杜鹃转录组SSR重复类型、分布频率等特征;基于SSR序列,设计了SSR引物对进行了多态性引物筛选、多样性和通用性分析。同时,以云锦杜鹃种子为材料,利用秋水仙素与氨磺乐灵处理进行多倍体诱导,并对诱导后植株的倍性、叶片性状进行了测定。主要研究结果如下:(1)通过测序数据的拼接和去冗余共获得8463条unigene序列,平均长度为691.4bp。通过与公共数据库比对成功注释到了35526条unigenes,其中与葡萄相似的序列最多。根据GO数据库将23215个unigene分为生物学过程、细胞组分及分子功能等三大类的55个功能组;KOG数据库将11085条unigene分为26个功能分类,涉及一般功能预测的unigene最多,多达1970条;以KEGG数据库作为参考,依据代谢途径可将9887个unigene定位到272个代谢通路。利用MISA软件对云锦杜鹃所有Unigenes进行分析,共发现21900个SSR位点,其中有含有1个以上SSR位点的序列有3606条,云锦杜鹃转录组SSR的分布频率为25.88%,双碱基重复SSR的12294个,占56.14%;双碱基SSR中,发生频率最高的是AG/CT,其次是AC/GT。该转录组将为云锦杜鹃遗传多样性分析、分子标记开发、杂交子代鉴定、分子辅助育种以及功能基因的挖掘提供重要基础。(2)根据云锦杜鹃SSR序列设计获得SSR引物8439对,随机选取45对SSR引物进行多态性分析。结果显示32个SSR位点具有多态性,多态性位点的等位基因介于2~8个,平均等位基因数5.25个;有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、香农多样性指数(I)和多态信息含量(PIC)的平均值分别为3.1755、0.7006、0.6404、1.3264和0.7017。采用UPGMA法对32个云锦杜鹃种质进行聚类分析,当遗传距离为0.7时,32份云锦杜鹃种质被分为了三个类群,表明了天台华顶林场野生云锦杜鹃种质资源的遗传多样性较为丰富。进一步的分析表明,其中25对SSR引物可在其他31种不同杜鹃属植物(或品种)中扩增出多态性条带,可转移率为78.125%,说明云锦杜鹃SSR引物在杜鹃属植物间具有较高的通用性。上述研究结果表明根据云锦杜鹃转录组开发的SSR引物能为云锦杜鹃遗传多样性分析、分子标记辅助育种、杜鹃属物种亲缘关系研究等提供丰富的标记资源。(3)利用不同浓度秋水仙素和氨磺乐灵对云锦杜鹃种子进行处理,诱导多倍体。结果显示秋水仙素处理后的种子萌发率没有显著明显变化,反而低浓度秋水仙素有促进种子萌发的作用;与对照相比,氨磺乐灵处理导致种子萌发率下降,10mg/L氨磺乐灵处理的种子萌发率为66.80%,而对照的萌发率为70.41%,但总体上氨磺乐灵处理后的种子萌发率与对照没有显著差异。对萌发15天后的种子苗进行观察,发现对照组的胚根最长,而随着秋水仙素浓度增加,种子苗胚根长度逐渐变短,当浓度达到0.2%时胚根萌发受到明显抑制,其根尖呈圆球状,胚轴比其他处理的种子苗粗且短;氨磺乐灵处理后的种子苗均没有明显的胚根长出,种子苗的胚轴较对照的胚轴粗,且能明显的看到子叶上长有细小的刺毛。利用流式细胞仪对5个月的诱变植株进行检测,发现发生倍性改变的植株比例为47.5%,对照组植株在流式细胞仪中检测出的数值平均大小为27.87,秋水仙素或氨磺乐灵处理后的二倍体的平均数值为27.73,四倍体平均数值为56.81,六倍体平均数值为75.43,八倍体植株的数值为106.61;其中四倍体的比例最高,达到23%;嵌合体的比例为17.5%,八倍体的植株比例为2.5%。在形态上,与二倍体相比,四倍体和八倍体植株高度及叶片大小均有明显的变小,但叶片变圆、颜色变深、叶片变硬、叶片加厚,叶表皮上的毛增多,且都是随着倍性的增加而增加。
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