论文部分内容阅读
研究背景心肌炎是好发于儿童及青壮年且存在死亡风险的非缺血性炎性心肌病变。由于缺乏特异性的诊断标记物及根治性的治疗方案,心肌炎的早期诊断和治疗被公认是世界范围内极具挑战性的临床难题。由于心肌炎的病因和发病机制尚未完全阐明,迄今临床一线治疗方案仍然以经验性对症支持治疗为主,无法从根本上逆转疾病的病理生理过程,高达9%-30%的儿童期心肌炎可进展为扩张型心肌病。深入研究心肌炎的病因和发病机制,探寻特异的诊断标记物和精准的治疗靶点,是提高临床诊疗水平和改善患者生活质量及预后的关键。随着分子生物学技术的发展和测序技术的改进,非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）已成为剖析疾病发病机制的关键突破口。转运RNA（transfer RNA,tRNA）来源的小非编码 RNA（tRNA-derived small noncoding RNA,tsRNA）是多种核酸酶剪切tRNA或tRNA前体所产生的具有调节功能的小非编码RNA,分为 tRNA 衍生片段（tRNA-derived fragment,tRF）和 tRNA 半分子（tRNA halves,tRH）两大类。其中哺乳动物的tRH也被称为tRNA来源应激诱导的小RNA（tRNA-derived stress-induced small RNA,tiRNA）。tsRNA结构稳定,保守性强,表达具有组织和时空特异性,可以调节基因的转录和翻译,影响表观遗传过程,对炎症、免疫、代谢、肿瘤等起关键调控作用,并且可以稳定地存在于体液,其中血浆tsRNA的表达量与疾病相关的组织细胞病变程度具有相关性,有望应用于液体活检,为揭示分子生物学功能提供新线索。目前国内外尚没有tsRNA在心肌炎中的表达、功能及其机制的相关研究。本课题首先应用高通量小RNA测序技术筛查与暴发性心肌炎（fulminant myocarditis,FM）相关的tsRNA。继而扩大样本量,借助Taqman荧光探针、实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）明确目标tsRNA,并借助临床指标及生物信息学对其临床意义和生物学功能进行初步评估。进而借助荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）、细胞计数试剂-8 法（cell counting kit-8,CCK-8）、Annexin V-藻红蛋白（phycoerythrin,PE）/7-氨基放线菌素 D（7-aminoactinomycin D,7-AAD）双染法流式细胞术、双荧光素酶报告基因检测实验、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）等探索目标tsRNA在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人心肌细胞炎症模型中的功能和机制,为心肌炎的早期诊断和治疗提供理论依据和新的靶点。本课题内容相应地分为三部分:第一部分tsRNA在儿童暴发性心肌炎中的表达、临床意义及生物学功能研究目的1.筛选并验证在FM急性期（FM-A）、FM恢复期（FM-C）及正常健康儿童（CON）血浆中存在差异表达的tsRNA。2.探讨目标tsRNA在FM急性期的表达量与临床评估心肌炎的常用指标之间的相关性,初步评估其临床意义。3.预测目标tsRNA的作用靶点及潜在的生物学功能。研究方法1.应用高通量小RNA测序技术检测FM-A组、FM-C组及CON组外周血浆tsRNA的表达谱,筛查与心肌炎发生发展相关且存在差异表达的候选 tsRNA。2.扩大FM-A组、FM-C组及CON组的样本量,并设置心力衰竭疾病对照（HF-CON）组,应用Taqman荧光探针及qRT-PCR技术对候选tsRNA进行验证,确定目标tsRNA。3.应用相关性分析评估目标tsRNA在FM急性期的表达量与临床评估心肌炎的常用指标之间的关系。4.借助tRFTar、DianaTools、TargetScan等数据库预测与目标tsRNA存在结合位点的候选靶基因。5.应用生物信息学方法,借助基因本体数据库（gene ontology,GO）及京都基因和基因组百科全书数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）的功能分析评估目标tsRNA的潜在生物学功能。6.统计学分析。研究结果1.高通量小RNA测序结果显示:每个测序文库获得平均702万个去掉接头之后的序列。以差异倍数≥1.5以及P值＜0.05为显著性差异表达,FM-A组和FM-C组共有7个存在差异表达的tsRNA,FM-A组和CON组共有13个存在差异表达的tsRNA,FM-C组和CON组则有703个不存在差异的tsRNA。2.qRT-PCR结果显示:tiRNA-Gln-TTG-001在FM-A组的表达量最高,较FM-C组上调2.29倍,较CON组上调3.49倍,较HF-CON组上调5.38 倍（P＜0.01）,故 tiRNA-Gln-TTG-001 被确定为目标 tsRNA。3.tiRNA-Gln-TTG-001在FM急性期的相对表达量（2-ACT）与超敏肌钙蛋白T、C-反应蛋白、降钙素原呈正相关（P＜0.05）,与中性粒细胞比值呈负相关（P＜0.05）,与氨基末端脑钠肽前体水平、白细胞计数、血沉、左室射血分数、早期钆强化率不存在相关性（P＞0.05）。4.tRFTar、DianaTools、TargetScan等数据库对氯化物细胞内通道蛋白4（Chloride intracellular channel 4,CLIC4）做出的预测评分最高。5.GO功能分析提示tiRNA-Gln-TTG-001与细胞凋亡、肌管分化和代谢等有关。KEGG代谢通路分析提示tiRNA-Gln-TTG-001的靶标可能涉及RAS、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、磷酸肌醇三激酶（PhosphoInositide-3 Kinase,PI3K）-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（protein serine threonine kinase,AKT）等多条信号通路,涵盖炎症和免疫等过程。结论1.在FM和健康儿童的血浆中存在差异表达的tsRNA。2.tiRNA-Gln-TTG-001可能与心肌炎的发生发展具有相关性,且存在疾病特异性。3.tiRNA-Gln-TTG-001可能与心肌的炎症损伤程度具有相关性。4.tiRNA-Gln-TTG-001可能通过靶向CLIC4在心肌炎中发挥作用。5.tiRNA-Gln-TTG-001可能与心肌细胞凋亡有关,可能通过调节炎症和免疫反应发挥作用。第二部分tiRNA-Gln-TTG-001在脂多糖诱导的AC16人心肌细胞炎症损伤的功能研究研究目的1.探索AC16人心肌细胞系（AC16）是否可以合成及分泌tiRNA-Gln-TTG-001。2.探索tiRNA-Gln-TTG-001在AC16的胞内分布情况。3.探索LPS是否可以诱导AC16建立细胞炎症模型。4.探索tiRNA-Gln-TTG-001在心肌细胞炎症模型中的表达及功能。研究方法1.应用qRT-PCR技术检测AC16及其上清液tiRNA-Gln-TTG-001的表达情况。2.构建花青素荧光染料（Cyanine 3,Cy3）标记的tiRNA-Gln-TTG-001探针,应用FISH技术对tiRNA-Gln-TTG-001在AC16的胞内分布进行定位。3.构建 tiRNA-Gln-TTG-001 mimics/inhibitor 以分别过表达/敲降 tiRNA-Gln-TTG-001。4.应用 lipofectamine 3000 转染 tiRNA-Gln-TTG-001 mimics/inhibitor。5.CCK-8确定细胞活性。6.Annexin V-PE/7-AAD双染法流式细胞术检测细胞凋亡和坏死。7.qRT-PCR及ELISA法确定炎症因子表达量的变化。8.ELISA法确定心肌损伤标记物及心功能标记物表达量的变化。9.统计学分析。研究结果1.AC16细胞及细胞上清液内均可检测到tiRNA-Gln-TTG-001。2.与Cy3标记的tiRNA-Gln-TTG-001探针杂交的AC16的细胞核和细胞质内均可探测到红色荧光。3.qRT-PCR证实AC16存在LPS受体同时也是炎症信号受体的Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）及其相关因子,具备LPS诱导建立细胞炎症模型的必要条件。4.在LPS刺激下,AC16的细胞活力显著降低（P＜0.01）,细胞凋亡和坏死显著增多（P＜0.01）,炎症因子白介素（interleukin,IL）-1β、IL-18在信使RNA（messenger RNA,mRNA）水平的表达量显著增高（P＜0.05）,细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18和心肌损伤标记物肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB,CKMB）、肌钙蛋白T（cardiac troponin,cTnT）的表达量显著增高（P＜0.01）,心功能标记物氨基末端 B 型脑利钠肽前体（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-proBNP）的表达量无显著性差异（P=0.8726）。5.在LPS刺激下,AC16细胞及细胞上清液tiRNA-Gln-TTG-001的表达量均显著增高（P＜0.05）,其中细胞tiRNA-Gln-TTG-001的表达量与AC16炎症损伤的发生发展存在时间相关性。6.相较于未转染的AC16,转染tiRNA-Gln-TTG-001 mimics的AC16的细胞活力显著降低（P＜0.01）,细胞凋亡和坏死显著增多（P＜0.01）,炎症因子IL-1β、IL-18在mRNA水平的表达量显著增高（P＜0.05）,细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18及心肌损伤标记物CKMB、cTnT的表达量显著增高（P＜0.01）,心功能标记物NT-proBNP的表达量无显著性差异（P=0.91）。7.相较于未转染的 AC16,转染 tiRNA-Gln-TTG-001 inhibitor 的 AC16 的细胞活力显著改善（P＜0.01）,细胞凋亡和坏死显著减少（P＜0.01）,炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18在mRNA水平的表达量显著降低（P＜0.05）,细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18及心肌损伤标记物CKMB、CTnT的表达量显著降低（P＜0.01）,心功能标记物NT-proBNP的表达量无显著性差异（P=0.4946）。结论1.AC16 可以生成和分泌 tiRNA-Gln-TTG-001。2.tiRNA-Gln-TTG-001分布于AC16的细胞核和细胞质。3.LPS可以诱导AC16建立细胞炎症模型。4.tiRNA-Gln-TTG-001可加重LPS诱导的AC16炎症损伤的程度。第三部分tiRNA-Gln-TTG-001加重脂多糖诱导的AC16人心肌细胞炎症损伤的机制研究研究目的1.探索CLIC4在心肌细胞炎症模型中的表达量,以及不同程度表达量的tiRNA-Gln-TTG-001 对 CLIC4 表达量的影响。2.探索CLIC4在AC16的胞内分布情况,以及CLIC4与tiRNA-Gln-TTG-001的空间关系。3.探索 tiRNA-Gln-TTG-001 是否与 CLIC4 mRNA 的 3’-非编码区域（3’-untranslated region,3’-UTR）存在结合位点。4.探索tiRNA-Gln-TTG-001加重LPS诱导的AC16炎症损伤的机制。研究方法1.应用qRT-PCR技术检测接受LPS刺激的未转染/转染tiRNA-Gln-TTG-001 mimics/inhibitor 的 AC16 中 CLIC4 的表达量。2.构建Cy3标记的tiRNA-Gln-TTG-001探针,FAM标记的CLIC4探针,应用FISH技术对CLIC4在AC16的胞内分布,以及CLIC4与tiRNA-Gln-TTG-001的分布关系进行定位检测。3.构建荧光素酶质粒CLIC4 mRNA的3’-UTR过表达组、CLIC4 mRNA的3’-UTR突变组、CLIC4 mRNA的3’-UTR阴性对照组,应用双荧光素酶报告基因检测实验验证tiRNA-Gln-TTG-001与CLIC4 mRNA的3’-UTR是否存在结合位点。4.构建 CLIC4 小干扰 RNA（small interfering RNA,siRNA）及过表达CLIC4的质粒。5.应用 lipofectamine 3000 分别转染 tiRNA-Gln-TTG-001 mimics+CLIC4 siRNA,以及 tiRNA-Gln-TTG-001 inhibitor+过表达 CLIC4 质粒。6.CCK-8确定细胞活性。7.Annexin V-PE/7-AAD双染法流式细胞术检测细胞凋亡和坏死。8.qRT-PCR及ELISA法确定炎症因子表达量的变化。9.ELISA法确定心肌损伤标记物及心功能标记物表达量的变化。10.统计学分析。研究结果1.qRT-PCR结果显示:在LPS刺激下,AC16中CLIC4的表达量显著增高（P＜0.05）。相较于未转染的AC16,过表达tiRNA-Gln-TTG-001的AC16中CLIC4的表达量显著升高（P＜0.05）,敲降tiRNA-Gln-TTG-001的AC16中CLIC4的表达量显著降低（P＜0.05）。2.与FAM标记的CLIC4探针杂交的AC16的细胞核和细胞质均可探测到绿色荧光,同时与Cy3标记的tiRNA-Gln-TTG-001探针和FAM标记的CLIC4探针杂交的AC16的细胞核和细胞质内可探测到红色及绿色荧光,且二者可重叠。3.双荧光素酶报告基因检测实验显示:tiRNA-Gln-TTG-001 mimics+CLIC4 mRNA的3’-UTR过表达组的荧光比值显著增高（P＜0.05）,即tiRNA-Gln-TTG-001与CLIC4 mRNA的3’-UTR存在固定互补的结合位点,且tiRNA-Gln-TTG-001存在激活CLIC4的潜力。4.在LPS刺激下,相较于单独转染tiRNA-Gln-TTG-001 mimics的AC16,转染 tiRNA-Gln-TTG-001 mimics+CLIC4 siRNA 的 AC16 中 CLIC4 的表达量显著降低（P＜0.05）,细胞活力显著改善（P＜0.01）,细胞凋亡和坏死显著减少（P＜0.01）,炎症因子IL-1β在mRNA水平的表达量显著降低（P＜0.05）,细胞上清液炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18及心肌损伤标记物CKMB、CTnT的表达量显著降低（P＜0.01）,心功能标记物NT-proBNP的表达量无显著性差异（P=0.8174）。5.在 LPS 刺激下,相较于单独转染 tiRNA-Gln-TTG-001 inhibitor 的 AC16,转染 tiRNA-Gln-TTG-001 inhibitor+过表达 CLIC4 质粒的 AC16 中CLIC4的表达量显著增高（P＜0.05）,细胞活力显著降低（P＜0.01）,细胞凋亡和坏死显著增高（P＜0.01）,炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18在mRNA水平的表达量显著增高（P＜0.05）,细胞上清液炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18及心肌损伤标记物CKMB、CTnT的表达量显著增高（P＜0.01）,心功能标记物NT-proBNP的表达量无显著性差异（P=0.9464）。结论1.CLIC4与tiRNA-Gln-TTG-001的表达存在时间同步性。2.CLIC4与tiRNA-Gln-TTG-001的分布存在空间同轨性。3.CLIC4与tiRNA-Gln-TTG-001的结合位点存在结构固定性和互补性。4.tiRNA-Gln-TTG-001通过上调CLIC4加重心肌炎症损伤。