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研究目的:研究系统性硬化症（Systemic sclerosis,SSc）患者与正常对照组外周血细胞因子表达及CD4+T淋巴细胞对人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblast,HSF）的作用;研究白细胞介素35（Interleukin 35,IL-35）对CD4+T淋巴细胞增殖、分化与分泌功能的影响,以及IL-35对HSF细胞增殖、迁移及分泌的作用,探究SSc患者CD4+T淋巴细胞功能改变与IL-35在SSc免疫调节及皮肤纤维化中的作用机制。研究方法:收集39例SSc患者与正常对照组外周血样本,通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测外周血细胞因子IL-35,IL-10,IL-17A,TGF-β的表达水平;免疫磁珠分选SSc患者与正常对照组外周血CD4+T淋巴细胞并与HSF细胞共培养,ELISA检测细胞培养基上清细胞因子IL-6、IL-10、IL-17A、TGF-β和IL-35的表达水平;Ki67免疫荧光染色评价HSF细胞增殖能力。使用梯度浓度重组人IL-35蛋白（rh IL-35）与CD4+T淋巴细胞共培养,CFSE染色检测CD4+T淋巴细胞的增殖水平;流式细胞术（FACS）检测调节性T细胞（Treg）分化水平;实时荧光定量PCR（q PCR）检测CD4+T淋巴细胞EBI3mRNA表达水平。培养HSF细胞并进行阳性鉴定,使用梯度浓度rh IL-35刺激培养HSF细胞,CCK-8法检测HSF细胞增殖水平;使用空白对照、rh IL-35、TGF-β与HSF细胞共培养,蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测HSF细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,人I型胶原蛋白（COL-1）的表达水平;细胞划痕实验检测HSF细胞迁移率。将rhIL-35处理的CD4+T淋巴细胞上清、空白CD4+T淋巴细胞上清及TGF-β与HSF细胞共培养,CCK-8法检测HSF细胞在24小时、48小时、72小时的增殖水平。研究结果:1.ELISA检测SSc患者及正常对照组外周血细胞因子表达结果显示,SSc患者较正常对照组IL-35表达水平增高（86.33±58.25 vs 48.46±29.88）,P<0.001;IL-17A表达水平增高（25.87±16.87 vs 17.17±4.59）,P<0.01;IL-10表达水平降低（1.97±1.07 vs 2.97±1.69）,P<0.01;TGF-β表达水平差异没有统计学意义（27.13±15.23 vs 40.21±21.86）,P=0.08。2.ELISA检测细胞培养基上清细胞因子表达结果显示IL-6在SSc患者组表达显著升高（0.15±0.07 vs 0.98±0.12）,P<0.001;IL-17A在SSc患者组表达显著升高（2.09±0.08 vs 2.43±0.08）,P<0.001,并且均与正常对照组差异有统计学意义,P<0.05。TGF-β在SSc患者组表达明显降低（622.07±12.25 vs 497.87±12.43）,P<0.001;IL-35在SSc患者组表达明显降低（7.42±0.08 vs 7.02±0.12）,P<0.01,并且均与正常对照组差异有统计学意义,P<0.05。IL-10在SSc患者组表达明显降低（143.52±5.41 vs 120.53±1.94）,P0.05。3.Ki67免疫荧光染色结果显示SSc患者组CD4+T淋巴细胞能够促进HSF细胞的增殖（0.06±0 vs 0.09±0.01）,P<0.01;并且与正常人CD4+T淋巴细胞组差异有统计学意义（0.09±0.01 vs 0.06±0.01）,P<0.01。4.CFSE染色检测CD4+T淋巴细胞增殖结果显示rh IL-35在10 ng/ml处理组（25.92±3.75 vs 19.05±0.56）,100ng/ml处理组（25.92±3.75 vs 14±2.76）,500 ng/ml处理组（25.92±3.75 vs 4.94±1.12）,均明显抑制CD4+T淋巴细胞增殖,P<0.05;在1ng/ml处理组（25.92±3.75 vs 23.4±2.8）结果无统计学差异,P=0.40。5.FACS检测Treg细胞分化结果显示100 ng/ml rh IL-35处理组Treg细胞比例较空白对照组增高（7.53±0.54 vs 8.77±0.44）,P0.05。6.实时荧光定量PCR结果显示,EBI3mRNA在1ng/ml rh IL-35处理组（1±0.12 vs 2.56±0.34）,P<0.01;10ng/ml rh IL-35处理组（1±0.12 vs1.79±0.41）,P<0.05;100 ng/ml rh IL-35处理组（1±0.12 vs 4.38±0.49）,P<0.001,表达量较空白对照组增加。在500 ng/ml rh IL-35处理组表达量较空白对照组降低（1±0.12 vs 0.14±0.05）,P<0.001。7.使用梯度浓度rh IL-35刺激培养HSF细胞,CCK-8法检测HSF细胞在24小时的增殖水平结果示,1 ng/ml rh IL-35（1.33±0.02 vs 1.28±0.02）,P<0.05;10 ng/ml rh IL-35（1.33±0.02 vs 1.24±0.03）,P<0.01;100 ng/ml rh IL-35（1.33±0.02 vs 1.19±0.02）,P<0.001;500 ng/ml rh IL-35（1.33±0.02 vs1.2±0.01）,P<0.001,均明显抑制HSF细胞增殖。100 ng/ml rh IL-35组与500 ng/ml rh IL-35组差异无统计学意义,P=0.42。TGF-β阳性对照组明显促进HSF细胞增殖（1.33±0.02 vs 1.44±0.02）,P<0.01。8.Western Blot检测HSF细胞中α-SMA、COL-1蛋白的表达水平,α-SMA蛋白在rh IL-35处理组表达显著降低（0.5±0.01 vs 0.4±0.01）,P<0.001,在TGF-β阳性对照组表达显著升高（0.5±0.01 vs 0.72±0.02）,P<0.001,rh IL-35处理组与TGF-β阳性对照组组间差异有统计学意义（0.4±0.01 vs0.72±0.02）,P<0.001;COL-1蛋白在rh IL-35处理组表达明显降低（0.46±0.01vs 0.24±0.01）,P<0.001,在TGF-β阳性对照组表达明显升高（0.46±0.01 vs0.63±0.03）,P<0.001,rh IL-35处理组与TGF-β阳性对照组组间差异有统计学意义（0.24±0.01vs 0.63±0.03）,P<0.001。9.细胞划痕实验结果示HSF细胞24小时迁移率在rh IL-35处理组降低（29.33±5.61 vs 14.67±4.7）,P<0.05,在TGF-β阳性对照组升高（29.33±5.61vs 47.2±1.9）,P<0.01,rh IL-35处理组与TGF-β阳性对照组组间差异有统计学意义（14.67±4.7vs 47.2±1.9）,P<0.001;HSF细胞48小时迁移率在rh IL-35处理组明显降低（60.27±6.96 vs 36.6±5.53）,P<0.01,在TGF-β阳性对照组明显升高（60.27±6.96 vs 99.8±0.35）,P<0.001,rh IL-35处理组与TGF-β阳性对照组组间差异有统计学意义（36.6±5.53 vs 99.8±0.35）,P<0.001。10.CCK-8法检测HSF细胞增殖结果显示,rh IL-35处理组在24小时（0.72±0 vs 0.55±0）,48小时（0.92±0 vs 0.81±0.02）,72小时（2.62±0.01 vs2.09±0.06）均明显抑制HSF细胞的增殖,P<0.001;TGF-β阳性对照组与rh IL-35处理组增殖水平在24小时（0.75±0.02 vs 0.55±0）,48小时（1.11±0.06vs 0.81±0.02）,72小时（2.98±0.06 vs 2.09±0.06）均有明显统计学差异,P<0.01。研究结论:1.SSc患者体内细胞因子表达异常,CD4+T淋巴细胞存在功能障碍,能够促进HSF细胞增殖及分泌促炎性细胞因子IL-6、IL-17A,抑制IL-35、IL-10及TGF-β的表达,SSc中异常的CD4+T淋巴细胞可能在系统性硬化症发病机制中发挥了重要的作用。2.IL-35能够抑制CD4+T淋巴细胞增殖并诱导Treg细胞分化,促进EBI3mRNA表达,发挥强大的抗炎作用;IL-35能够抑制HSF细胞的增殖、迁移及相关胶原蛋白表达从而抑制皮肤纤维化进程,IL-35在系统性硬化症慢性炎症及纤维化病变中发挥了重要的免疫抑制作用。