重组病毒活载体疫苗等亚单位疫苗是动物疫苗研发的重要方向,免疫佐剂对亚单位疫苗至关重要。Toll样受体（TLR）的激动剂是很有开发前景的分子佐剂,脑膜炎奈瑟球菌Ag473脂蛋白或其D1区、创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB和结核分枝杆菌热应激蛋白70（mHsp70）均有较强的免疫佐剂作用,但缺少系统性的比较研究。本研究先以传染性法氏囊病毒（IBDV）VP2为指示抗原,以小鼠为动物模型,对三种TLR激动剂进行两种使用方式的佐剂活性比较。进而以重组腺病毒为载体,非洲猪瘟病毒（ASFV）CD2v-p30-p54融合蛋白（称为F1）为指示抗原,对两种TLR激动剂的黏膜佐剂活性进行比较研究,旨在为动物亚单位疫苗的免疫佐剂选用提供科学依据。1.TLR激动剂和重组病毒抗原的大肠杆菌表达与鉴定制备的重组蛋白包括TLR激动剂Ag473、FlaB、mHsp70,IBDV VP2及其TLR激动剂融合蛋白 D1-VP2、FlaB-VP2、VP2-Hsp70 以及 ASFVCD2v、p30 和 p54。将其编码序列插入pET-30a（+）载体,将重组载体转化BL21（DE3）大肠杆菌,用IPTG诱导重组蛋白表达,利用镍亲和层析进行重组蛋白纯化,用免疫转印进行重组蛋白鉴定,用MALDITOF/TOF质谱分析D1-VP2融合蛋白的脂质修饰。SDS-PAGE分析显示单独表达的7个重组蛋白的分子量与预测分子量相符,其中Ag473、mHsp70、CD2v、p30和p54为可溶性表达,FlaB和VP2为不溶性包涵体表达;3个融合表达蛋白的分子量也与预测分子量相符,其中VP2-Hsp70为可溶性表达,D1-VP2和FlaB-VP2为不溶性表达。所有纯化蛋白的纯度大于94%,能被His标签特异抗体或ASFV抗体识别。切除信号肽后的D1-VP2融合蛋白的N端肽断为6个氨基酸长,脂质修饰与Ag473脂蛋白相同。这些结果表明制备重组蛋白可用于TLR的佐剂活性比较研究。2.三种TLR激动剂及其使用方式的佐剂活性比较将51只BALB/c小鼠分为8个试验组和1个对照组,试验组小鼠肌肉注射相同摩尔数的 VP2、D1-VP2、FlaB-VP2、VP2-mHsp70、VP2+Ag473、VP2+FlaB 或 VP2+mHsp70,对照组注射100μlPBS,免疫后第14天加强免疫1次。免疫后不同时间采血分离血清,用ELISA测定抗原特异性抗体水平。免疫后28天扑杀小鼠分离脾淋巴细胞,经VP2抗原刺激后用ELISA测定细胞因子表达。结果显示:在TLR激动剂与VP2混合免疫组中,Ag473+VP2免疫组的VP2抗体水平显著高于mHsp70+VP2和FlaB+VP2免疫组;脾淋巴细胞经VP2抗原刺激后,Ag473+VP2免疫组的IL-4、IL-12表达水平高于其它两组,FlaB+VP2免疫组的IFN-γ和TNF-α表达水平高于其他两组。在TLR激动剂与VP2融合表达免疫组中,D1-VP2免疫组的VP2抗体显著高于FlaB-VP2和VP2-mHsp70免疫组,并显著高于Ag473+VP2免疫组;脾细胞经VP2抗原刺激后,D1-VP2免疫组的IL-4、IL-12、IFN-γ表达水平高于VP2-mHsp70免疫组和FlaB-VP2免疫组,VP2-mHsp70免疫组的TNF-α表达水平高于其他两组。这些结果表明混合使用型和融合表达型Ag473的总体佐剂活性均强于其mHsp70和FlaB,融合表达型TLR激动剂的佐剂活性优于混合使用型TLR激动剂。3.融合表达TLR激动剂与ASFV抗原的重组腺病毒构建分别将mHsp70、FlaB与ASFVCD2v-p30-p54融合基因（称为F1）克隆入腺病毒载体,用获得的重组质粒转化B J5183-AD-1大肠杆菌,用获得的重组质粒转染HEK293A细胞,获得重组腺病毒rAd-F1、rAd-FlaB-F1和rAd-F1-mHsp70。用HEK293A细胞进行rAd放大和滴度测定,结果显示3轮放大的3个rAd的滴度分别为8×108、1×109和5×108TCID50/mL。用ASFV抗体阳性血清进行免疫荧光试验,结果显示3个rAd感染细胞均为免疫荧光检测阳性。免疫转印结果显示rAd-F1、rAd-FlaB-F1和rAd-F1-mHsp70感染细胞分别表达125kDa、140kDa和170kDa的融合蛋白,其分子量显著大于预测分子量,可能与融合抗原中CD2v、p54的糖基化修饰有关。这些研究结果提示构建的rAd可用于TLR激动剂的佐剂活性比较研究。4.两种TLR激动剂对ASFV融合抗原的黏膜佐剂活性比较将11头仔猪分为4组,第1-3组分别用rAd-F1、rAd-FlaB-F1和rAd-F1-Hsp70进行鼻腔喷雾免疫,初免后第21天加强免疫1次,第4组鼻腔喷雾PBS作为对照。免疫后不同时间采血分离血清,用ELISA检测抗原特异性IgG和IgA抗体;采集鼻腔棉拭子样品,用ELISA检测抗原特异性IgA抗体水平;采集外周血单个核细胞（PBMC）,重组抗原刺激后用ELISA检测细胞因子表达。免疫后第35天扑杀试验猪,分别采集气管漂洗液和肺灌洗液,用ELISA检测IgA抗体;从猪肺分离肺泡巨噬细胞（PAM）,重组抗原刺激后用ELISA检测细胞因子表达。结果在免疫后第7天,所有免疫猪均为抗原特异性血清IgG和IgA抗体阳性,加强免疫后抗体水平显著升高,其中rAd-FlaB-F1免疫组的抗体水平显著高于rAd-F1免疫组,但低于rAd-F1-Hsp70免疫组,鼻液、气管漂洗液和肺灌洗液的抗原特异性IgA抗体变化趋势相似;对于抗原刺激PBMC的细胞因子表达,rAd-FlaB-F1免疫组的IL-2、IL-4、IL10、IFN-γ表达水平高于rAd-F1免疫组,但低于rAd-F1-Hsp70免疫组。对于抗原刺激PAM的细胞因子表达,rAd-FlaB-F1免疫组的IL-4和IFN-α表达水平显著高于rAd-F1免疫组,但显著低于rAd-F1-Hsp70免疫组;IL-10表达水平显著高于rAd-F1免疫组,但略低于rAd-F1-Hsp70免疫组;IL-1β表达水平略高于rAd-F1免疫组,但显著低于rAd-F1-Hsp70免疫组;各组IL-12表达水平无显著差异。这些研究结果提示,mHsp70的黏膜佐剂活性优于FlaB,主要与刺激IL-4、IL-10 和 IFN-α产生有关。