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H9N2亚型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）当前在我国广泛流行,不仅对家禽养殖业造成巨大的经济损失,同时还可跨种间传播感染人,潜在威胁公共卫生安全。活禽市场从业人员中较高的抗体阳性率表明H9N2亚型AIV跨种间感染人的现象非常普遍,但由于对人的致病性较低导致H9N2感染人的报道较少。AIV对哺乳动物的致病性是多基因协同作用的结果,其中影响毒株受体结合特性的HA以及影响AIV在哺乳动物细胞中复制能力的PB2基因起到重要作用。因此探究H9N2 HA和PB2关键氨基酸变异对哺乳动物的致病性以及致病机制对防控未来可能存在的大流行具有重要的指导意义。本实验室在对华东地区活禽市场进行流行病学监测过程中分离到一株H9N2毒株,该毒株在HA和PB2蛋白上天然具有多个哺乳动物标记位点,但对小鼠为低致病性。为了探究可增强该H9N2毒株对小鼠致病性的其它分子标记,我们通过人工适应以及自然毒株基因序列比对分析的方法发现了多个未曾报道的HA蛋白关键位点,同时对这些位点导致H9N2对小鼠致病性增强的机制进行了探究。1 天然携带哺乳动物分子标记的H9N2病毒SDKD1/15株生物学特性测定在对华东地区AIV进行流行病学调查过程中,我们分离到一株天然具有哺乳动物分子标记的禽源H9N2毒株A/chicken/Eastern China/SDKD1/2015（SDKD1/15）。该毒株在HA蛋白上存在可增强AIV对α-2,6-SA结合能力的226L和228S分子标记;同时在PB2蛋白上存在可增强AIV在哺乳动物细胞中复制能力的E627K突变。在体外实验中,SDKD1/15毒株具有双受体结合特性,在哺乳动物源细胞中的复制效率显著高于禽源细胞,表明对哺乳动物的适应性较好。在对小鼠致病性实验中,SDKD1/15虽然天然具有HA（226L和228S）和PB2-627K等哺乳动物分子标记,但仅可在小鼠个别器官中进行短暂的低滴度复制,对小鼠为低致病性（MLD50>107.5 EID50）。另外SDKD1/15可通过气溶胶的方式在鸡群中传播,具备在家禽中大流行的潜力;同时可通过气溶胶传播的方式感染豚鼠,具有较强的跨种间传播能力。综上所述,我们的研究表明虽然SDKD1/15毒株在一定程度上适应了哺乳动物,但还需要基因组其它未知位点的协助才能增强H9N2毒株对哺乳动物的致病性。2 H9N2毒株SDKD1/15在小鼠体内的适应性研究为了探究H9N2在哺乳动物体内的适应机制,我们将SDKD1/15毒株在小鼠肺脏中连续六次传代获得对小鼠致病性显著增强的SDKD1-P6毒株。相比于野生毒株,SDKD1-P6在全基因组中仅在HA蛋白上存在T187P,222-224位缺失（△222-224）和M227L突变,这些位点均位于受体结合区或邻近区域。通过反向遗传学实验发现△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均可显著增强H9N2毒株在小鼠肺脏和气管中的复制水平和持续时间,以及对肺脏的病理损伤,从而增强对小鼠的致病性。在体外实验中,△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均可显著增强H9N2毒株在感染哺乳动物细胞初期的复制水平,增强毒株在MDCK细胞中形成噬斑的能力。以上生物学特性的改变是由于HA蛋白突变（△222-224,T187P+M227L）可显著增强H9N2毒株对α2,6-SA受体的结合能力,以及对哺乳动物细胞和小鼠肺脏组织的亲和力。流感病毒的传播性同样和HA蛋白密切相关。△222-224单独突变以及T187P+M227L联合突变均不能使H9N2通过气溶胶的方式在豚鼠间传播,但T187P+M227L可使H9N2毒株具备在豚鼠间接触传播的能力。流感病毒对宿主的致病性是多基因共同作用的结果。我们的研究表明HA蛋白突变（△222-224,T187P+M227L）需和PB2-627K协同作用才能导致H9N2增强对小鼠的致病性,另外这种特性不只在母本毒株SDKD1/15中起作用,在其它H9N2毒株中可获得同样的结论,因此排除毒株特异性。综上所述,我们的研究新发现了 HA受体结合区及邻近区域位点变异协同PB2-627K增强H9N2对小鼠致病性,并阐明了致病机制,为防范H9N2病毒在未来可能存在的大流行提供了有价值的信息。3 HA蛋白受体结合区198位变异影响H9N2亚型AIV对小鼠致病性的机制研究AIV在适应进化的过程中可自然发生氨基酸突变,但需要多个关键突变位点的积累才能使毒株具备跨种间传播和对宿主致病性增强的能力,因此很多重要的突变在毒株生物学特性改变之前不能被及时发现,导致应对大流行的滞后性。在本章的研究中我们发现同样具有PB2-627K分子标记的两株H9N2拯救毒株对小鼠的致病性存在显著差异,其中HA蛋白是导致这种差异的决定性因素。通过反向遗传学技术进行差异氨基酸的正向和反向单点突变,发现198N和198T分别可显著降低和增强H9N2毒株在小鼠肺脏中的复制水平以及对小鼠的致病性。198位氨基酸位于HA蛋白头部区域的190-helix区域,同时N198T突变导致HA蛋白糖基化位点数目的减少,因此该位点的改变可能影响毒株的受体结合特性。我们的研究表明198T和198N分别可显著增强和降低H9N2毒株对小鼠肺脏组织的亲和力,这或许是导致突变毒株对小鼠致病性不同的原因。流感病毒对宿主的致病性是多基因共同作用的结果,HA-198T同样需要和PB2-627K联合作用才能导致H9N2毒株增强对小鼠的致病性。另外198位氨基酸位点的改变不影响H9N2毒株的抗原性以及热稳定性。重要的是,可增强对小鼠致病性的198T分子标记在当前H9N2流行毒株中占绝对优势（93.82%）,表明H9N2对公共卫生安全的威胁较大。综上所述,我们的研究新发现了 HA蛋白受体结合区优势流行位点198T和PB2-627K协同作用可显著增强H9N2亚型AIV对小鼠的致病性,为防范未来可能存在的H9N2大流行提供了预警信息。4 HA蛋白受体结合区222-224位缺失增强H9N2亚型AIV对小鼠致病性的宿主因素分析决定病毒对宿主致病力强弱的因素包括两个方面:一个是病毒本身的特性,另一个是病毒感染后宿主所作出的应答。我们将感染rSDKD1-WT和rSDKD1-△222-224毒株的小鼠肺脏进行转录组和蛋白质组联合测序分析,发现HA蛋白△222-224突变使H9N2毒株诱导更多的宿主基因和蛋白差异表达。进一步的生物信息功能分析结果表明rSDKD1-△222-224诱导的差异基因/蛋白参与的免疫相关生物过程条目显著多于rSDKD1-WT毒株;KEGG通路分析结果显示rSDKD1-WT毒株诱导的少数差异基因/蛋白仅参与RIG-I-like受体信号通路,而rSDKD1-△222-224毒株诱导的差异基因/蛋白参与了几乎所有重要的免疫相关信号通路。我们进一步对这些天然免疫相关基因/蛋白的表达水平进行了分析,结果显示rSDKD1-△222-224毒株可使大部分蛋白/基因表达水平上调,个别下调。综上所述HA蛋白△222-224突变使H9N2毒株诱导了更广泛以及更强烈的免疫反应,异常的免疫应答导致了严重的肺脏病理变化,因此增强了对小鼠的致病性。