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天然免疫由相关细胞内一系列能够识别病原相关模式分子（PAMP）的模式识别受体（PRR）所介导。这些模式识别受体包括Toll样受体（TLR）、RIG-I样受体（RLR）、NOD样受体（NLR）、C型凝集素受体（CLR）和胞质DNA受体（CDR）。这些PRR激活下游信号通路,通过产生炎症细胞因子、Ⅰ型干扰素和其他介质诱导先天免疫应答。Toll样受体（TLR）是最早发现的天然免疫受体家族,其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6主要位于细胞表面质膜,负责识别脂质、脂蛋白和蛋白质等微生物膜成分,而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9定位于内体,主要参与微生物核酸的识别。TLR8属于TLR7/8/9亚家族。该亚家族不同成员之间具有保守的结构、细胞定位和激活机制,但具体功能仍具有较大差异。由于TLR8信号通路信息相对缺乏,以及TLR8与TLR7的相似性,在大多数情况下,TLR8信号通路信息都是参考TLR7相关信息。另外动物TLR8相关信息尤其缺乏,特别需要系统深入研究。因此,本项课题针对猪TLR8受体蛋白,分别从配体识别、膜外域（ECD）定位、信号通路调控及抗感染等方面进行初步探索,以丰富猪TLR8信号通路机制及抗感染作用信息。具体内容如下:1.猪TLR8与小分子配体咪唑喹啉衍生物互作位点鉴定及其种属特异性研究人TLR8（hTLR8）晶体结构已解析,其ECD与小分子配体作用位点也已清晰,而猪TLR8（pTLR8）ECD结构和小分子作用位点都不清楚,其小分子作用位点是否与hTLR8位点存在差异值得研究。以hTLR8（PDB ID:3W3J）为模板构建pTLR8三维结构模型,并进行进一步优化。Ramachandran图分析评价模型质量。接着用该模型与小分子配体咪唑喹啉衍生物R837和R848进行分子对接,将得到的9个识别位点中8个位点成功构建突变体:Y336A、Q340A、K341A、K342A、Y343A、F395A、I560A和G562A。hTLR8小分子识别重要保守位点对应pTLR8同源位点Y338、F395、V510、D533和T564,与前面预测位点重叠或接近,显示了分子对接有效性。考虑到TLR8受体Z-loop区域的重要作用,我们根据之前报道的Z-loop相关序列,同时构建了 Z-loop相关序列缺失、置换突变体:hTLR8-ΔRQSYA、hTLR8-sub-pGQKNG、pTLR8-ΔGQKNG、pTLR8-sub-hRQSYA,及 pTLR8 Z-loop 相关序列点突变体:G428A、K430A、N431A、G432A。将野生型TLR8和各个突变体质粒分别转染HEK-293T细胞,Western blotting检测其表达。结果显示,所有蛋白表达均符合预期。共聚焦免疫荧光观察结果显示,所有TLR8蛋白均能够与转染表达内体蛋白Rab5共定位,表明所有TLR8蛋白均定位于内体。将TLR8和各个突变体分别与NF-κB-启动子虫萤光素酶报告基因、Actin-启动子海肾荧光素报告基因共转染HEK-293T细胞,并用小分子配体R837、R848、CL075刺激。双荧光素酶报告实验结果显示,Y336、K341、K342、F395和G562对R837、R848和CL075刺激pTLR8信号通路至关重要。另外之前报道的hTLR8 Z-loop相关序列RQSYA尽管是CL075刺激活性所必需,但不是R848刺激活性所必需。与此对照,pTLR8相应的Z-loop相关序列GQKNG对CL075、R837和R848刺激活性都不重要。以上结果均显示了 pTLR8和hTLR8之间在识别小分子配体激活下游信号方面尽管具有相似性,但也有细微差异,显示了种属特异性。2.猪TLR8膜外域（ECD）的细胞内定位及其细胞内体定位机制分析我们之前研究发现TLR8膜外域（ECD）在细胞内定位,但其细胞内亚定位及其机制不清楚,需要探究。首先将猪pTLR8、pTLR8-ECD、pTLR3-ECD、pTLR5-ECD、牛 bTLR8-ECD、人 hTLR8-ECD、牛疱疹病毒 1（BHV-1）糖蛋白 gD、gD-ECD等表达质粒分别转染HEK-293T细胞,Western blotting和荧光显微镜分别检测细胞上清和细胞内蛋白表达情况。结果显示,除gD-ECD能够分泌到细胞上清之外,其它所有蛋白均在细胞质内表达,表明不同种属和类别TLRECD细胞质内定位具有普遍性。此外,pTLR8-ECD、bTLR8-ECD、hTLR8-ECD均能够在细胞内质网和内体定位,而在高尔基体和溶酶体没有定位。为探测蛋白信号肽和各种翻译后修饰可能对TLR8-ECD细胞内体亚定位的影响,利用在线预测工具对pTLR8-ECD的信号肽、磷酸化、泛素化、糖基化、乙酰化、泛素化和棕榈酰化等翻译后修饰位点进行预测,并构建相应突变体pEGFP-C1或pEGFP-N1表达质粒。将野生型pTLR8-ECD、信号肽缺失体和各种翻译后修饰位点突变体分别与内体定位蛋白表达质粒（pDsRed-C1-pRab5）共转染转染HEK-293T细胞。共聚焦荧光显微镜观察结果显示,磷酸化、泛素化、糖基化、乙酰化和棕榈酰化都不影响pTLR8-ECD在细胞内体的定位,而信号肽缺失的pTLR8-ECD在细胞内体定位消失。为研究细胞伴侣转运蛋白UNC93B1对TLR8-ECD细胞内体定位的影响,用CRISPR-Cas9方法制备UNC93B1基因敲除（KO）的猪肺泡巨噬细胞（PAM）。将 pTLR8-ECD、bTLR8-ECD、hTLR8-ECD 分别和 pDsRed-C1-pRab5 转染 PAM细胞及UNC93B1 KO PAM细胞。共聚焦荧光显微镜结果显示,所有ECD蛋白均能定位于PAM细胞内体,而在UNC93B1 KOPAM细胞,不同种类ECD蛋白细胞内体定位消失,显示了 UNC93B1对TLR8-ECD在细胞内体定位的重要性。3.猪TLR8信号通路特异性表达基因、负反馈调控及抗感染作用研究为研究pTLR8和hTLR8信号通路的种属特异性,我们筛选并构建出hTLR8-NF-κB和pTLR8-NF-κB信号报告细胞。用R848分别刺激两种细胞,提取总RNA进行转录组测序分析。结果显示,R848激活的pTLR8细胞中有502个差异表达基因（DEG）,而hTLR8细胞中有1157个DEG。其中149个是pTLR8特异性DEG,804个是hTLR8特异性DEG,353个是hTLR8和pTLR8共有DEG。挑取部分上调DEG分别在两种信号报告细胞、PAM细胞和THP-1细胞进行RT-qPCR验证,表达结果与测序结果一致。在pTLR8特异性DEG中,GO功能富集分析表明生物过程类别的细胞识别项显著富集,该细胞识别项包含7个pTLR8特异性DEG,其中3个上调DEG:CATSPERG、HAVCR2、CNTN2。这三种上调DEG在PAM细胞中得到验证,其中HAVCR2（TIM-3）为免疫抑制基因,其表达上调可能对pTLR8信号通路存在负反馈调控作用。基于此,构建pTIM-3表达载体。将pTIM-3和pTLR8表达质粒共转染HEK-293T细胞,R848刺激12小时后,启动子试验检测NF-κB活性,Western blotting检测pTIM-3对pTLR8信号下游AKT、p-AKT、p65、p-p65等信号蛋白表达的影响。另外用AKT抑制剂A-443654处理转染细胞,检查其对pTLR8下游NF-κB活性的影响。结果显示,pTIM-3可通过抑制AKT磷酸化进而抑制R848刺激pTLR8信号通路引起的NF-κB活化。不同浓度R848（0,5,10,20,30μg/mL）刺激处理PAM细胞,表现对鼠伤寒沙门氏菌的剂量依赖性抑制作用,表明TLR8信号的抗感染作用。分别在PAM细胞中表达或者沉默pTIM-3基因,并用不同浓度R848（0,5,10,20,30 μg/mL）刺激TLR8信号,观察TIM-3负反馈调控对TLR8信号抗鼠伤寒沙门氏菌的影响。结果显示,表达TIM-3显著减弱了 R848刺激PAM细胞对鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果,而沉默TIM-3则增强了 R848刺激PAM细胞对鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果。上述结果表明,免疫抑制基因TIM-3负反馈干扰了 TLR8信号的抗感染作用,这一发现为TLR8信号抗感染研究提供了新靶标。