第一章:野生型小鼠心衰模型中重组可溶性Corin的疗效研究目的:心房利钠肽（Atrial natriuretic peptide,ANP）和 B 型利钠肽（B-type natriuretic peptide,BNP）是心脏内分泌机制的一类重要激素,具有扩张血管、排钠利尿以及维持机体心血管稳态的作用。在心脏中,ANP信号通路也起到抗心脏肥厚和抗炎症的作用。利钠肽以前体形式（pro-ANP或pro-BNP）合成,经蛋白酶激活后才能转化为有活性的ANP或BNP。心力衰竭患者血浆中pro-ANP和pro-BNP水平显著升高,提示这些患者中利钠肽的转化过程是一个潜在的限速步骤。Corin是一种激活心脏中利钠肽的跨膜丝氨酸蛋白酶。Corin蛋白表达和功能受损与心衰相关。心衰患者血浆中Corin水平显著降低,且降低程度与临床不良预后有关。这些研究结果提示:心衰患者血浆中pro-ANP和pro-BNP水平显著升高,但Corin活化酶不足,Corin成为了转化过程中的限速酶。本章节中,我们在野生型（Wide-type,WT）小鼠心衰模型中给予重组可溶性Corin（sCorin）治疗,探讨sCorin对心衰的改善作用。研究方法:1.取10-12周龄雄性WT小鼠,构建心肌梗死（Myocardial infarction,MI）与主动脉弓缩窄（Transverse aortic constriction,TAC）诱导的小鼠心衰模型。2.术后1周,小鼠每天腹腔注射重组sCorin（3 mg/kg）或等体积对照溶剂,持续3周（MI）或7周（TAC）。3.在小鼠术前和术后,每周行超声心动图测量左心室的结构和收缩功能。4.在术后4周（MI）或8周（TAC）,计算心重和肺重与体重或胫骨长度比值,评估心肌肥厚与肺充血程度。5.对心脏组织切片进行苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,H＆E）、麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）、Masson和天狼猩红染色,评估小鼠心脏结构、心肌细胞大小与纤维化程度。6.术后4周（MI）或8周（TAC）收集血浆和左心室组织样本,通过ELISA试剂盒检测血浆 ANP、BNP、环磷酸鸟苷（Cyclic guanosine monophosphate,cGMP）、N-端（NT）pro-ANP、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平以及左心室组织中cGMP水平。研究结果:1.我们通过结扎冠状动脉左前降支建立了小鼠MI诱导的心衰模型。MI术后1周,小鼠左心室收缩功能发生障碍,心肌细胞缺血坏死,心脏纤维化瘢痕组织增加,并出现肺充血现象。2.TAC术后8周,小鼠心脏收缩功能显著下降,心脏体积变大,出现心肌肥厚表型,表现为心重与体重比值增加。3.超声心动图检测结果显示,经重组sCorin治疗2周（MI）或5周（TAC）时,心衰小鼠的左心室射血分数和短轴缩短率显著高于溶剂对照组,心功能得到改善。4.组织学分析结果显示,心衰小鼠经重组sCorin治疗后心重和肺重与体重或胫骨长度的比值显著下降,提示小鼠心肌肥厚与肺充血程度得到改善。5.组织学染色结果显示,心衰小鼠经重组sCorin治疗后心脏纤维化瘢痕组织减少,心肌细胞短轴直径降低,提示小鼠心脏结构得到改善。6.ELISA检测血浆及心脏组织结果显示,心衰小鼠经重组sCorin治疗后血浆中ANP、BNP和cGMP以及左心室组织中cGMP水平增加,血浆中NT-pro-ANP、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平降低,提示重组sCorin治疗增强了体内利钠肽的加工和活性,并抑制了肾素-血管紧张素-醛固酮系统。结论:在两种独立的野生型小鼠心衰模型中,重组sCorin治疗增强了利钠肽的加工和活性,抑制了肾素-血管紧张素-醛固酮系统,改善了小鼠心脏的形态和功能,并缓解了肺充血程度。第二章:Corin基因敲除小鼠心功能改变以及心衰模型中重组可溶性Corin的疗效研究目的:迄今为止,CORIN基因突变体已在不同种族的高血压和心脏病患者中被报道,提示CORIN基因突变直接损害了 Corin的表达、活化以及转化利钠肽前体的功能,进而导致高血压、心肌肥厚。那么,Corin缺乏是否直接导致心功能障碍?在病理情况下,Corin的缺乏是否会加速心功能障碍?在这种病理情况下,我们再给予重组sCorin治疗,能否改善心功能?因此本章节中,我们拟用Corin基因敲除（Knockout,KO）小鼠为模型,探讨Corin缺陷对心功能的影响,以及心衰模型中重组sCorin的疗效。研究方法:1.取6月龄和12月龄雄性WT和Corin KO小鼠,利用超声心动图检测心功能随年龄的变化情况,评估Corin基因缺陷是否导致心功能障碍。2.取10-12周龄雄性Corin KO小鼠,建立主动脉弓缩窄（TAC）诱导的小鼠心衰模型,比较WT和Corin KO小鼠TAC后心功能变化过程。评估在病理情况下Corin基因缺乏是否加速心功能障碍。3.Corin KO小鼠TAC术后1周,小鼠每天腹腔注射sCorin（3 mg/kg）或等体积对照溶剂持续7周,手术8周后取组织分析。在小鼠术前和术后每周行超声心动图测量心功能。4.TAC手术8周后,分析心重和肺重与体重或胫骨长度比值。评估心肌肥厚与肺充血程度。5.TAC手术8周后,心脏组织切片进行H＆E、WGA、Masson以及天狼猩红染色,评估Corin KO小鼠心脏结构、心肌细胞大小与组织纤维化程度。6.利用qRT-PCR检测心脏组织中心衰相关基因肌球蛋白重链Myh7、结缔组织生长因子Ctgf、心房利钠肽Nppa和B型利钠肽Nppb基因的表达水平。7.术后8周收集血浆样本,ELISA检测血浆cGMP、NT-pro-ANP、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平。研究结果:1.在12月龄时,与WT小鼠相比,Corin KO小鼠射血分数显著降低,提示Corin KO小鼠在12月龄时心脏功能发生障碍。2.在TAC模型中,当射血分数（Ejection fraction,EF）下降到50%的时间点,在WT小鼠中为6.0±0.2周,而在Corin KO小鼠中为3.9±0.1周,明显早于WT小鼠,提示Corin基因缺失会加速小鼠心衰的发生发展过程。3.超声心动图结果显示,经sCorin治疗7周时,Corin KO小鼠左心室射血分数和短轴缩短率显著增加,提示Corin KO心衰小鼠心功能有所恢复。4.组织学分析显示,经sCorin治疗后Corin KO小鼠心肌肥厚和纤维化程度减少,心肌细胞直径降低,肺组织中含铁血黄素沉积减少,提示Corin KO心衰小鼠心脏结构和肺充血得到改善。5.qRT-PCR结果显示,Corin KO心衰小鼠经sCorin治疗后心衰相关基因Myh7、Ctgf、Nppa和Nppb表达水平显著降低。6.ELISA结果显示,Corin KO心衰小鼠经sCorin治疗后,血浆cGMP水平增加,NT-pro-ANP、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平降低。结论:Corin基因缺失小鼠在12月龄时心脏功能发生障碍。在TAC模型中,Corin KO小鼠心脏射血分数降至50%的时间点为～3.9周明显早于WT小鼠的时间点～6.0周,提示Corin基因缺失会加速小鼠心衰的发生发展过程。Corin KO小鼠TAC心衰模型中给予重组sCorin治疗后,增强了小鼠体内利钠肽的加工和活性,改善了心脏形态与功能,这与野生型小鼠心衰模型中的结果一致。第三章:探讨Corin基因敲除对小鼠心肌细胞及心脏损伤反应的影响研究目的:Corin-ANP系统对维持机体血压平衡至关重要。在心脏中,ANP还具有局部抗心肌肥厚功能,这与其全身降压作用不直接相关。ANP和Corin缺乏都可导致小鼠出现高血压和心肌肥厚表型。那么,Corin敲除小鼠心脏的病变是由血压上升造成还是由心脏局部因素造成?换言之,在小鼠中,Corin基因缺陷除了对血压升高继发性影响以外,是否对心脏的结构和功能有直接的影响?因此,在本章节中,我们主要探讨Corin基因敲除对小鼠心肌细胞及心脏损伤反应的影响。研究方法:1.利用差速贴壁分离法从WT和Corin KO新生小鼠心脏中分离原代心肌细胞并进行培养,观察心肌细胞形态与自主搏动频率。2.取10-12周龄雄性WT和Corin KO小鼠进行结扎冠状动脉手术,统计小鼠一天内存活率。当Corin KO小鼠术后死亡时取心脏组织,并以同一时间点WT小鼠心脏组织为对照进行分析。3.对心脏组织进行（Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的免疫组织化学分析,评估心肌梗死面积和TNF-α表达水平。4.利用qRT-PCR方法检测WT和Corin KO小鼠心脏组织中炎症因子TNF-α、白细胞介素6（Interleukins,IL-6）IL-1β和IL-10基因的表达水平。5.取10-12周龄雄性WT和Corin KO小鼠进行液氮低温冻伤心脏实验,统计成活率。冻伤术后48 h取心脏组织进行H＆E染色,观察组织形态。6.取10-12周龄雄性WT和Corin KO小鼠心脏,在体式显微镜下观察左右冠状动脉形态,并分析左右冠状动脉粗细。将心脏组织从主动脉根部至心尖进行连续切片,通过免疫组化与免疫荧光进行平滑肌肌动蛋白α-SMA（动脉平滑肌标记物）染色,观察冠状动脉管壁形态变化。研究结果:1.WT与Corin KO新生小鼠原代培养的心肌细胞在细胞形态、细胞数量以及增殖速度上无显著区别。心肌细胞均呈长杆状、梭形以及多边形。Corin敲除对小鼠原代心肌细胞的自主搏动频率也无显著影响。2.冠状动脉结扎后,Corin KO小鼠成活率显著降低。TTC染色结果显示心肌梗死面积无明显差异。炎症因子mRNA水平以及TNF-α蛋白水平同样无显著差异。提示与WT小鼠相比Corin KO小鼠MI术后成活率低,并非由于心肌梗死面积、炎症因子水平的差异导致。3.心脏受液氮低温损伤后,Corin KO与WT小鼠均可存活,且生存率无显著差异。H＆E组织学分析也未见两组小鼠明显差异。提示Corin KO小鼠MI术后成活率低的主要原因可能并非是对心脏损伤的直接过激反应。4.冠状动脉分析结果显示:Corin KO小鼠的冠状动脉较细,管壁较薄,提示冠状动脉的结构差异或许是导致Corin KO小鼠心肌梗死术后成活率低的原因之一。结论:Corin基因敲除对新生小鼠原代培养的心肌细胞的形态、数量和增殖速度以及心肌细胞自主搏动频率无显著影响。Corin KO小鼠在冠状动脉结扎后成活率降低,这或许与其冠状动脉结构异常有关。