研究目的临床流行病学调查发现抑郁患者向帕金森病（Parkinson’s disease,PD）转化的风险高于与之对照研究的非抑郁人群,但其中促进转化的关键分子目前尚未明确,且转化过程中发生的系列变化及特点亦不清楚。建立抑郁向PD转化的动物模型将有助于深入研究PD和PD抑郁的发病机理及寻找潜在的干预靶点。本研究的目的是建立抑郁向PD自然转化的模型,探索转化过程中发生的生物学改变,筛选出伴随转化而发生改变的关键性分子,并阐明其在PD发病中的作用及可能机制,以期为PD和PD抑郁的防治提供新思路。研究方法1、新生SD雄性大鼠出生后第1至21天,每天与其母鼠分离3小时以诱导抑郁,即为母婴分离（maternal separation,MS）组,简称MS组;对照组则不做分离,简称Ctrl组。两组均正常饲养至60周龄,并在第9周、36周、60周时应用行为学（糖水偏好实验、埋藏食物小球实验、旷场实验和自动步态分析）、神经影像学（micro-PET/CT）和生物化学（免疫印迹、高效液相色谱分析和免疫组化染色）等实验方法评估两组SD大鼠在抑郁样行为、嗅觉功能、运动能力和黑质-纹状体多巴胺系统功能等方面的变化。2、在第60周时对两组SD大鼠进行纹状体转录组学测序和功能分析,以评估PD相关基因差异表达变化情况,同时结合文献调研筛选出值得关注的关键性差异表达基因,并应用实时定量PCR（real-timequantitative PCR,qRT-PCR）和免疫印迹的方法验证筛选结果的可靠性。3、在腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）的亚急性 PD 小鼠模型和双侧脑黑质立体定向注射6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）的PD大鼠模型上检测所选差异表达基因编码的蛋白在纹状体中的表达变化情况是否与MS诱发抑郁自然转化中的变化一致。4、根据被筛选出来的下调分子谷氨酸转运体-1（glutamate transporter-1,GLT-1）在脑内的分布特点和功能特性,我们通过脑立体定向注射的方法将载有Glt-1 shRNA且能特异性感染星形胶质细胞的重组腺相关病毒（rAAV9-hGFAP-EGFP-5’miR-30a-shRNA（Glt-1）-3’miR-30a）注射到8周龄SD雄性大鼠的纹状体中以下调GLT-1蛋白表达水平,设为敲减组（Glt-1 KD组）;对照组注射空载病毒（rAAV9-hGFAP-EGFP-5’miR-30a-shRNA（Scramble）-3’miR-30a）,称为 Scramble 组。在病毒注射后第6周时,对两组SD大鼠进行行为学（转棒实验、旷场实验、自动步态分析、糖水偏好实验和埋藏食物小球实验）、神经影像学（micro-PET/CT）和生物化学（免疫印迹和免疫组化染色）检测以评估两组SD大鼠在运动能力、抑郁样行为、嗅觉功能和黑质-纹状体多巴胺系统功能等方面的变化。5、体外进行原代星形胶质细胞和原代中脑神经元的离体培养。首先,利用siRNA干扰技术对原代星形胶质细胞上的Glt-1进行敲减（对应组别简称Glt-1 KD组）,并设阴性处理为对照（对应组别简称NC组）。随后再在Transwell共培养体系中与原代中脑神经元共培养,其中部分共培养体系中会同步加入GLT-1激动剂头孢曲松。共培养72小时后,取培养基上清以检测其中谷氨酸的含量,并通过免疫荧光染色观察原代中脑神经神经元中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）阳性神经元的形态学变化;同时,通过钙成像技术与免疫印迹检测原代中脑神经元的钙信号变化。研究结果1、与Ctrl组SD大鼠相比,MS组SD大鼠在成长中表现出稳定的抑郁样表型,并随着年龄的增加逐渐出现嗅觉功能损害、自主运动距离缩短及行走步态站立和制动时间增加。Micro-PET/CT和免疫印迹结果显示MS组SD大鼠纹状体多巴胺系统受损,高效液相色谱分析提示其纹状体多巴胺递质水平下降约33%。同时,免疫组化染色结果也提示MS组SD大鼠黑质TH阳性神经元数量较Ctrl组SD大鼠减少约20%。2、60周龄时的转录组学测序分析结果提示:MS组SD大鼠纹状体中发生改变的差异表达基因显著富集到多巴胺能突触通路,以及自主运动和神经肌肉控制平衡两个生物学过程中。通过进一步的条件限制性筛选,同时结合文献调研和蛋白互作网络分析,我们将Slc1a2（solute carrier family 1 member 2）基因从众多差异表达基因中筛选出来。通过qRT-PCR和免疫印迹检测证明该基因及其编码的GLT-1蛋白在MS组60周龄SD大鼠纹状体中的表达水平降低,这与60周时在纹状体转录组学测序分析中发现其为下调性差异表达基因的结果吻合。3、在腹腔注射MPTP的亚急性PD小鼠模型和双侧脑黑质立体定向注射6-OHDA的PD大鼠模型上,我们均检测到纹状体区域GLT-1蛋白表达水平下降。另外,我们还发现相较于生理盐水组,两种PD模型鼠均表现出抑郁样行为（MPTP亚急性PD小鼠在悬尾实验中表现出不动时间延长;6-OHDA处理的PD大鼠在糖水偏好实验中表现出糖水摄入比例减少）。4、在体脑立体定向注射Glt-1敲减或空载病毒6周后,Glt-1 KD组SD大鼠与Scramble组SD大鼠相比,运动能力下降（转棒实验中在棒时间减少、旷场实验中总的运动距离缩短）、步态出现异常（右后肢平均站立时间和平均制动时间均延长）,并有抑郁样表现（糖水摄入比例减少）,但未出现嗅觉障碍（两组大鼠找到食物小球的时间无统计学差异）。Micro-PET/CT提示Glt-1 KD组大鼠敲减侧纹状体区域多巴胺转运体显像异常（放射信号低于自身非敲减侧及Scramble组双侧）。免疫印迹结果发现Glt-1 KD组SD大鼠敲减侧的纹状体中TH蛋白表达水平减少,且免疫组化染色结果也表明Glt-1 KD组SD大鼠敲减侧的黑质中TH阳性神经元数量变少。5、离体细胞实验中免疫荧光染色结果显示Glt-1 KD组原代中脑神经元中TH 阳性神经元的形态较NC组出现异常,表现为神经突起数量减少、长度缩短;而给予GLT-1激动剂头孢曲松处理可恢复其形态学改变。超高效液相色谱三重四级杆质谱检测发现Glt-1 KD组上清谷氨酸含量较NC组增加。钙成像检测结果提示Glt-1 KD组340 nm/380 nm 比值较NC组变大。免疫印迹结果显示Glt-1 KD组磷酸化钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ的表达量较Ctrl组增多。研究结论1、纹状体GLT-1下调在MS抑郁模型大鼠发生增龄性PD样改变中具有重要作用,靶向敲减纹状体星形胶质细胞Glt-1可以引起SD大鼠出现PD样运动行为学和病理学改变,并伴有抑郁样行为发生。2、星形胶质细胞GLT-1的缺乏可以导致多巴胺能神经元出现形态学损伤,且该损伤的发生可能和GLT-1减少后引发的谷氨酸蓄积所导致的钙信号异常有关。3、GLT-1是防治PD和PD抑郁的潜在靶点。