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多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)属于革兰氏阴性菌,根据其荚膜抗原不同分为A、B、E、D、F 5种血清型,根据其菌体抗原不同分为16个血清型。P.Multocida能够感染多种动物,引起牛出血性败血症、牛肺炎、禽霍乱、猪萎缩性鼻炎等,给养殖业带来了严重的经济损失。细菌感染机体过程中,细菌的定殖和繁殖与其粘附素有着密切关系。近年来研究发现一种新的非菌毛粘附素-三聚体自转运粘附素(TAAs),被认为是一种重要的毒力因子,它主要由头部、茎部和锚定部三部分组成,其中头部和茎部是其主要功能区,参与细菌的粘附、侵袭、生物膜形成,与其自身凝集和抗血清作用也有一定关系;锚定部是TAAs家族特有的结构,具有三聚化作用,可以抑制SDS变性作用。来源于不同细菌TAAs的锚定部序列具有高度同源性,不同的氨基酸个数决定了TAAs的多样性。此外TAAs也可以作为研究新型亚单位疫苗的候选靶标。目前国内外对TAAs的研究比较少,只对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的TAAs有相关研究,但是关于巴氏杆菌还未见报道。本实验室前期通过生物信息学分析得到一个牛源A型多杀性巴氏杆菌的假定三聚体自转运蛋白编码基因pm1g0001。本实验将其作为研究对象,通过分子生物学相关技术从理论和试验方面证明其编码的pm1g0001蛋白是YadA属三聚体自转运蛋白;并通过免疫反应原性分析、粘附活性分析、生物膜形成方面来研究该蛋白具有的部分TAAs生物学功能。具体研究结果如下:1、三聚体自转运粘附素编码基因pm1g0001的生物信息学分析根据本试验室建立的牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2株基因数据库,利用生物信息学在线分析软件SignalP-3.0 server、TMHMM Server v.2.0、SMART对假定三聚体自转运粘附素Pm1g0001基因的信号肽、跨膜结构域进行分析;利用三聚体自转运黏附素分析软件daTAA分析蛋白的黏附基序。结果显示,该蛋白编码基因Pm1g0001的1-22aa为信号肽区域、1-84aa为跨膜域、211-411aa为TAAs部分,其中taas的ylhead头部基序主要位于n端211-284aa处,茎部主要位于295-341aa,c端锚定部基序主要位于323-411aa处,说明该蛋白含有三聚体典型的头-茎-锚结构,从理论上证明该假定蛋白是三聚体自转运蛋白家族的成员。利用bcepredserver在线软件对蛋白pm1g0001的b抗原表位进行线性化的预测;利用bepipred1.0server在线软件和dnastar软件包分析蛋白的二级结构、抗原指数、亲水性、可极性等,预测蛋白pm1g0001的b抗原表位,综合分析表明,pm1g0001的抗原表位主要位于21-315aa。2、三聚体自转运蛋白编码基因的分段表达及其表达产物western-blot分析生物信息学分析结果发现,三聚体部分主要位于pm1g0001基因编码蛋白的211-411aa。根据分析结果,将pm1g0001分为整个pm1g0001基因(pm1g0001)、整个功能区(头部和颈部:pm1g0001-1)、锚定部(pm1g0001-2)、整个三聚体部分(pm1g0001-3)、非三聚体部分(pm1g0001-4)、头部(pm1g0001-5)和茎部(pm1g0001-6)7段,分别设计特异性引物并进行pcr扩增,扩增产物经纯化后,以pet-30a(+)或pet-32a(+)为载体,转入dh5α感受态中构建重组质粒,再将重组质粒转入bl21(de3)感受态细胞,经诱导表达后得到重组蛋白。利用his亲和层析柱将7个重组蛋白进行大量纯化,并将产物进行western-blot分析。结果发现7个重组蛋白都具有良好的反应原性;此外,重组蛋白rpm1g0001-2在78kda处有条带,是单体重组蛋白(26kda)的3倍,说明该蛋白锚定部具有三聚化的作用,由此证明蛋白pm1g0001是三聚体自转运蛋白家族的成员。3、三聚体自转运蛋白pm1g0001的功能研究将纯化后的重组蛋白rpm1g0001、rpm1g0001-1~rpm1g0001-6分别与佐剂混合后免疫小鼠,三免后,采集小鼠血液分离血清,采用elisa检测其抗体效价;同时用6.8×105cfu的pmcq2肌肉注射攻毒小鼠,研究目的蛋白对小鼠的免疫保护效果。结果显示,免疫组抗体效价范围在1:51200~1:102400,说明重组蛋白可以刺激小鼠体内产生高水平的免疫应答反应;其中重组蛋白rpm1g0001-3的抗体效价明显高于其余6组,说明三聚体自转运蛋白可以刺激机体产生高滴度的抗体。攻毒保护性试验结果显示,重组蛋白rpm1g0001-3的保护效果最好,保护率达到70%,说明三聚体自转运粘附素对巴氏杆菌的感染具有很好的保护作用;重组蛋白rpm1g0001-5和rpm1g0001的保护率达到60%,rpm1g0001-1和rpm1g0001-6的保护率是40%,rpm1g0001-2保护率仅为10%,说明在整个rpm1g0001中起主要作用的是三聚体部分,而在三聚体中起主要作用的是功能区,其中功能区头部作用效果好于茎部。将纯化后的重组蛋白rPm1g0001-1、rPm1g0001-3、rPm1g0001-5、rPm1g0001-6免疫小鼠,制备多克隆抗体。用制备好的抗体和阴性血清对C57BL/6小鼠巨噬细胞进行预处理后,加入PmCQ2感染4h,洗去未粘附的细菌,经洗脱后进行粘附计数,以研究重组蛋白抗体对巴氏杆菌粘附小鼠巨噬细胞的影响。结果表明,四种多克隆抗体都对PmCQ2粘附巨噬细胞有一定的抑制作用,且差异显著;其中抗-Pm1g0001-3对细菌粘附的抑制效果明显好于其余三组,说明三聚体自转运蛋白抗体对巴氏杆菌粘附宿主细胞具有一定的抑制作用,其中起主要作用的是功能区。将PmCQ2(1×108 CFU)加入细胞培养板中分别培养24h、48h、72h,检测生物膜形成情况,在此基础上,将制备的多克隆抗体抗-Pm1g0001-1、抗-Pm1g0001-3、抗-Pm1g0001-5、抗-Pm1g0001-6与阴性血清分别对含细菌的细胞培养板进行预处理,并测定各组的吸光值A630,以研究重组蛋白抗体对细菌生物膜形成的影响。结果表明,多杀性巴氏杆菌PmCQ2可以形成细菌生物膜,48h时形成生物膜现象最明显;经抗体预处理的4个实验组A630极显著低于对照组,说明4种抗体都能够抑制细菌生物膜的形成,且在48h时抑制效果最好;48h时,抗-Pm1g0001-1的抑制效果最佳,抗-Pm1g0001-3的抑制效果好于抗-Pm1g0001-5和抗-Pm1g0001-6,抗-Pm1g0001-6的抑制效果好于抗-Pm1g0001-5,说明三聚体自转运蛋白抗体可以抑制细菌生物膜的形成,其中功能区起主要作用,且功能区中茎部抑制效果好于头部。