研究背景我国食管癌负担甚重,全球50%以上的食管癌病例来自我国。以内镜为主的现行筛查技术方案人群预防效果明显,主要适用于在高发区人群直接开展内镜筛查。该方案目前面临的主要问题是:由于缺乏高危人群浓缩和高危个体预测分子生物学指标,筛查效率和效益较低,难以迅速在一般人群中大范围推广应用。肿瘤抑制基因CDKN2A/P16基因(以下简称P16基因)的遗传/表观遗传失活是食管癌发生过程中的早期事件,在食管癌组织中该基因拷贝缺失频率高达60%以上。目前对于P16的遗传和表观遗传失活在食管癌发生过程中的变化规律,不同取样方法的一致性,及其与环境危险因素暴露之间的关系,是否可用于食管癌初筛及癌前病变预测预警均缺乏研究。研究目的本研究依托我国食管癌高发区人群筛查队列资源,分析食管癌组织中P16基因DNA甲基化和拷贝缺失的发生情况,并评价食管癌组织内的异质性对P16基因DNA甲基化检测结果的影响;分析P16基因DNA甲基化和拷贝缺失在食管癌发生过程中不同阶段的内镜活检组织、脱落细胞中的发生情况及其用于食管癌早期筛查的可行性;探索食管海绵球检查的人群接受性和脱落细胞采样效率,旨在为我国食管癌内镜早诊早治和筛查方案优化提供证据。材料与方法在食管癌高发区肿瘤专科医院招募住院病例,收集食管癌的癌及癌旁组织,检测P16基因DNA甲基化和拷贝数缺失情况;独立设计系统取样方法,收集食管癌患者手术组织的肿瘤模拟内镜活检组织及对应肿瘤部位切检组织和癌旁模拟内镜活检组织,对所有组织进行病理诊断和P16基因DNA甲基化,定量评价食管肿瘤异质性对病理诊断和P16基因DNA甲基化的影响。依托河南林州上消化道肿瘤筛查人群队列,收集不同级别的食管癌及癌前病变的常规内镜活检组织标本,内镜下刷取脱落细胞标本,分别对其进行P16基因DNA甲基化、拷贝数缺失检测,对比分析不同病变级别、不同方法取样标本的P16基因DNA甲基化阳性率,明确不同类型标本P16基因DNA甲基化的检测一致性;以组织病理诊断为金标准,结合环境暴露危险因素等信息,建立预测预警模型,评价P16基因DNA甲基化在食管癌及其癌前病变的初筛中的应用效果。依托人群筛查队列,首先应用食管海绵球收集食管脱落细胞标本,进行食管海绵球检查的接受性问卷调查,开展内镜检查,内镜下客观同步评价海绵球采样对食管粘膜的影响;提取海绵球采样的脱落细胞标本DNA,评价食管海绵球检查的人群接受度及食管脱落细胞标本采集的有效性。利用P16基因DNA甲基化诊断性测定方法和刚创建的该基因拷贝缺失定量检测方法,分别采用荧光PCR技术为基础的MethyLight和P16Light方法进行P16基因DNA甲基化和拷贝数缺失的检测。结果判定:以COLA2A为内参基因(Ct<29.3),当3个平行检测管中至少2个甲基化P16基因扩增的Ct值<40,样品定义为P16基因DNA甲基化阳性;分别计算待测样品(癌、癌前病变组织)和参照样品(癌旁组织、白细胞)的P16相对拷贝数,若待测样品P16相对拷贝数比例低于参照样品的20%且p<0.05时,该样品定义为拷贝数缺失阳性。采用紫外分光光度仪和荧光定量PCR对食管海绵球获取的标本进行DNA浓度和β-ACT基因表达水平检测。采用SPSS 26.0软件对研究数据进行整理和统计学分析,显著性α为0.05。同一研究对象的癌、癌旁组织的P16基因DNA甲基化的Ct值差异比较采用配对样本的t检验;不同组间研究对象的P16基因DNA甲基化和拷贝数缺失阳性率的差异比较和趋势判断采用卡方检验。选取多因素Logistic回归分析中:1)p<0.05;2)p<0.25,OR>1.7或OR<0.5的因素进入回归模型。采用灵敏度、特异度、AUC等来描述各指标对食管病变的诊断准确性。研究结果1.常规取样食管癌组织中P16基因DNA甲基化、拷贝数缺失阳性率分别为63.0%(51/81)、66.7%(54/81),单因素分析提示:P16基因DNA甲基化、拷贝数缺失与年龄、肿瘤体积和肿瘤分期等因素有关。P16基因DNA甲基化与拷贝数缺失存在显著相关性(p<0.01),一致率为54.3%。早期食管癌组织中两个指标的联合检出率达88.8%,提示两者之间可能存在互补性。2.系统采样法收集组织中,配对的切检取样和模拟内镜活检取样组织的病理诊断一致率为65.0%;P16基因DNA甲基化阳性率分别为85.0%、68.9%,一致率为55%。癌旁组织的病理诊断异常率和P16基因DNA甲基化阳性率为15.7%、54.9%,并随其距肿瘤边缘距离的增加而下降。3.在内镜活检食管癌和癌前病变组织标本中P16基因DNA甲基化和拷贝数缺失的阳性率分别为20.9%和37.2%。P16基因DNA甲基化与研究对象的年龄、病变级别呈正相关,而拷贝数缺失阳性率仅与病变级别有显著关系。拷贝数缺失对不同级别病变诊断的准确性均高于甲基化,并联两个指标后的准确性均高于单独诊断,并在低级别上皮内瘤变及以上病变中达到最大值,灵敏度为58.8%,特异度为 95.2%,AUC 为 0.72(0.61-0.83)。4.食管脱落细胞标本P16基因DNA甲基化的总体阳性率为18.1%(19/105)。正常/炎症、低级别、高级别癌前病变、癌的阳性率分别为4.8%(3/62)、25.0%(3/12)、37.5%(3/8)、43.5%(10/23),随着病变级别的增加逐步升高。单独采用食管脱落细胞P16基因DNA甲基化检测时,对高级别上皮内瘤变及以上病变的准确性最高,灵敏度、特异度分别为41.9%、91.9%,AUC为0.67(95%CI:0.55-0.79)。结合P16基因DNA甲基化后的环境暴露多因素Logistic回归模型对食管病变的预测准确性显著高于单纯的人群危险因素模型,对低级别及以上病变的准确性最高,灵敏度和特异度分别为86.1%、87.1%,AUC为0.93(95%CI:0.88-0.98)。5.内镜刷取的脱落细胞标本P16基因DNA甲基化在低级别及以上病变中的阳性率为37.2%(16/43),显著高于活检组织标本的20.9%(9/43)。以组织病理诊断为金标准,P16基因DNA甲基化在食管癌(手术/活检组织)、高级别、低级别病变和正常/炎症中的阳性率分别为62.6%(72/115)、44.8%(13/29)、34.3%(12/35)和15.0%(25/167),与病变级别呈现正向相关趋势(p<0.01)。6.80.0%受试者食管海绵球检查过程中没有出现难以忍受的痛苦和焦虑,50.0%的受试者出现了窒息感或呕吐感。海绵球检查对粘膜的影响较轻,主要是“无出血的浅表粘膜磨损”。食管海绵球可有效获取食管脱落细胞,DNA平均浓度为146.4ug/uL,经25、50倍稀释后,其β-ACT基因的平均Ct值分别为26.67和27.81。研究结论1.P16基因DNA甲基化和拷贝数缺失在食管癌组织中均广泛存在,二者在食管癌的早期诊断和筛查方面有潜在的应用前景。2.食管肿瘤异质性会显著影响肿瘤组织标本中P16基因DNA甲基化的检测结果。食管肿瘤中心部位组织在病理诊断、P16基因DNA甲基化检测方面更具有代表性,癌旁组织的P16基因DNA甲基化状态与其距肿瘤的距离密切相关。3.P16基因DNA甲基化和拷贝数缺失阳性率与食管病变级别密切相关。食管脱落细胞P16基因DNA甲基化检测可有效发现食管癌及癌前病变,结合P16基因DNA甲基化的预测模型在食管癌初筛方面具有潜在的应用价值。4.食管海绵球检查可有效获取食管脱落细胞,且人群接受性良好,有望用于食管癌人群初筛。