【研究背景】急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是以造血干/祖细胞克隆性扩增引起的血液系统恶性肿瘤,好发于中老年人,具有发病急,复发率高,存活率低的特点。白血病起始细胞（Leukemia initiating cells,LICs）是AML复发的主要原因,具有自我更新能力和分化能力,对化疗药物耐受。特异性靶向LICs被认为是治疗AML最有前景的策略。前期研究提示免疫分子可向LICs内部传递信号,调控LICs自身的增殖、自我更新及分化;另一方面,LICs通过表面分子与niche中的基质细胞相互作用,在对niche的重塑及免疫逃逸中发挥重要的作用,因此免疫分子可从细胞本身及微环境两方面特异性靶向LICs,寻找新的可调控LICs干性的特异性表面分子是靶向LICs治疗的关键之一。前期通过对人AML细胞系MA9细胞免疫分子库筛选,筛选出一系列高表达的免疫分子,B7-H4是其中免疫抑制分子的一个代表。另一方面,近年研究表明,性激素受体分布于全身各个组织器官,作用靶点广泛,不仅与生殖及性功能有关,而且与代谢、心血管功能、认知、情绪、骨密度、肌肉强度、免疫功能等密切相关。性激素水平的异常与代谢紊乱、心血管疾病、肿瘤发生密切相关。中老年人群中,AML的高发是否与性激素的异常有关?下丘脑-垂体-性腺轴激素在人群中随着年龄的增加又是如何变化的?目前并不清楚。【目的】研究B7-H4对LICs干性维持的作用及机制以及下丘脑-垂体-性腺轴激素在人群中随年龄的变化趋势。【方法】首先采用real-time PCR和流式细胞仪检测B7-H4在正常造血干细胞,病人及小鼠模型中的LICs细胞及白血病细胞系中的表达情况。分别用小鼠B7-H4野生型(B7-H4+/+)及B7-H4敲除型(B7-H4-/-)造血干/祖细胞,感染MSCV-MLL-AF9-YFP病毒,建立小鼠白血病模型,利用系列移植的方法,研究B7-H4对LICs的自我更新能力及白血病发生发展的影响。分别通过瑞氏姬姆萨染色,PI染色或Pyronin Y/Hoechst33342染色及Annexin V/7AAD染色检测B7-H4对LICs的分化、细胞周期及凋亡的影响。通过m RNA sequence检测B7-H4+/+及B7-H4-/-LICs细胞的差异基因,并用real-time PCR及Western blot验证差异基因在B7-H4+/+及B7-H4-/-白血病小鼠中的表达。通过慢病毒过表达载体及sh RNA,分别在小鼠白血病细胞系C1498细胞过表达B7-H4及干扰RCOR2表达,检测细胞增殖、分化及细胞周期的改变,并用Western blot及real-time PCR检测相关基因的变化。利用sh RNA干扰B7-H4-/-白血病细胞中高表达的RCOR2后,分别在体外通过克隆形成实验及体内移植,与未干扰的B7-H4-/-白血病细胞及B7-H4+/+白血病细胞比较,通过体外形成的克隆数及受体小鼠生存率的比较,明确RCOR2在B7-H4对LICs干性调控中的作用;采用Western-blot法检测B7-H4/RCOR2调控网络信号通路AKT、Cyclin D1、CDK4、RUNX1等相关蛋白的表达,利用免疫共沉淀、荧光素酶报告基因系统及特异性抑制剂研究B7-H4调控Rcor2及cyclin D1、Runx1的机制。利用整群分层抽样的方法,入组华东地区三个省16个研究地点共6825个年龄在25-93岁之间的受试者,包括2908名男性及3917名女性,利用免疫法检测受试者总睾酮、雌二醇、性激素结合球蛋白、卵泡刺激素及黄体生成素水平,通过多元线性回归,分析这些激素随年龄的变化。【结果】○1 B7-H4高表达于小鼠YFP+白血病细胞、YFP+Mac-1+c-Kit+LICs,病人CD34+LICs及AML细胞系中。○2在小鼠白血病模型中,B7-H4敲除缺失型LICs受体小鼠外周血白血病细胞的频率明显高于B7-H野生型LICs受体小鼠,肝脾肿大更为明显,小鼠的生存时间明显缩短;外周血中Mac-1+/Gr-1-的未分化细胞频率明显升高,而Mac-1+/Gr-1+已分化细胞频率降低,骨髓染色中未成熟白血病母细胞明显增多;富集LICs的Mac-1+/c-Kit+细胞群的频率虽然无明显差异,但体外CFU的形成能力明显增强;进入S期的LICs细胞明显增多,但凋亡无明显差异。○3 m RNA sequence结果显示,B7-H4+/+和B7-H4-/-LICs有512个差异基因,其中241个基因上调,271个基因下调。GO分析表明B7-H4可能在染色质组装,转录和免疫反应中具有重要的作用。○4 B7-H4-/-白血病细胞AKT信号活化,与干细胞分化及自我更新相关的RCOR2,与细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4及抑制分化的蛋白RUNX1的表达均明显上升;在小鼠白血病细胞系C1498中过表达B7-H4或干扰RCOR2表达后,细胞生长明显变慢,处于S期细胞频率下降,细胞分化程度增加。○5干扰B7-H4-/-白血病细胞中RCOR2的表达后,体外CFU形成能力明显下降;移植到小鼠体内后,小鼠白血病细胞明显减少,生存时间明显延长。○6过表达B7-H4后抑制AKT活性,RCOR2,Cyclin D1,CDK4及RUNX1表达下调,干扰RCOR2的表达后,Cyclin D1、RUNX1的表达下降,抑制AKT后,Cyclin D1表达下调,但RCOR2不受影响。○7 B7-H4在胞浆及胞核中均有表达;可与AKT、Cyclin D1直接相互作用,与RCOR2不能直接作用,但RCOR2可结合到Runx1启动子区。○8在校正了人口因素,代谢因素,生活方式及其他激素的影响后,男性总睾酮的水平随年龄的增加而增加。【结论】B7-H4在AML中发挥抑癌的作用,可抑制LICs的自我更新,促进其分化,阻滞其细胞周期。而B7-H4发挥这些作用,一方面是通过抑制AKT信号通路的活性抑制Cylin D1来实现的;另一方面是通过抑制RCOR2的表达从而抑制Cyclin D1及RUNX1来实现的。AML在中老年人群中高发可能与性激素水平随年龄的变化有关。