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胆囊癌细胞耐药,具有干细胞特性的胆囊癌侧群（side population,SP）细胞耐药性更强,是影响化疗疗效的主要原因之一。我们前期研究发现升高胆囊癌细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平能下调耐药相关蛋白、提高细胞对顺铂（CDDP）的敏感性,但ROS水平的升高如何促进耐药相关蛋白下调尚不清楚。研究提示,髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia 1,Mcl-1）是抗凋亡蛋白,可导致细胞化疗耐药,其稳定性受到氧化还原修饰—谷胱甘肽化修饰的调控。这提示我们升高ROS可能通过谷胱甘肽化修饰途径下调Mcl-1蛋白,逆转胆囊癌细胞耐药。但在胆囊癌细胞、尤其是SP细胞中,Mcl-1和CDDP耐药的关系,以及谷胱甘肽化修饰对Mcl-1的影响仍不清楚。本研究拟阐明Mcl-1在胆囊癌细胞、SP细胞CDDP耐药中的作用和谷胱甘肽化修饰调控Mcl-1蛋白稳定性的机制,并证明通过异硫氰酸苯乙酯（PEITC）增加Mcl-1的谷胱甘肽化修饰可加强胆囊癌细胞CDDP敏感性。此外,Mcl-1的转录因子信号传导与转录激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3）活性被报道也受到谷胱甘肽化修饰的调控,我们拟证明通过调控STAT3的谷胱甘肽化修饰可抑制Mcl-1蛋白生成、改善胆囊癌细胞CDDP耐药特性。第一部分:髓细胞白血病-1在胆囊癌细胞对顺铂耐药中的作用研究目的:研究胆囊癌细胞、胆囊癌SP细胞对CDDP耐药中Mcl-1蛋白的作用。方法:检测CDDP诱导下胆囊癌GBC-SD细胞Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1蛋白表达量变化。检测Mcl-1蛋白在SP细胞和非SP细胞中的表达差异。检测Mcl-1蛋白在人胆囊癌和慢性炎症胆囊组织中的表达差异。用siRNA下调Mcl-1蛋白表达,检测沉默Mcl-1蛋白对CDDP诱导细胞凋亡的影响。结果:1.CDDP特异性诱导胆囊癌细胞Mcl-1蛋白表达增加,并不增加Bcl-2、Bcl-x1蛋白表达。2.胆囊癌SP细胞中Mcl-1蛋白表达量明显高于非SP细胞。3.人胆囊癌组织Mcl-1蛋白表达率（71.4%）明显高于慢性炎症胆囊组织（26.7%）。4.沉默Mcl-1蛋白能显著增加CDDP诱导的细胞凋亡。结论:抗凋亡蛋白Mcl-1是胆囊癌细胞对CDDP耐药、胆囊癌SP细胞更耐药的原因之一。第二部分 异硫氰酸苯乙酯增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:在普通肿瘤细胞系、SP细胞、裸鼠移植瘤三个层面观察Mcl-1靶向药物PEITC和CDDP治疗胆囊癌细胞的协同效应,并探讨机制。方法:分对照、PEITC、CDDP、PEITC/CDDP联合处理4组,处理胆囊癌GBC-SD细胞、胆管癌RBE细胞、胆囊癌SP细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术定量细胞凋亡率,试剂盒检测细胞caspase 3活性,western-blot检测细胞Mcl-1蛋白表达量。用胆囊癌GBC-SD细胞接种裸鼠28只建立荷瘤动物模型,成瘤达50mm3后随机分为对照、PEITC、CDDP、PEITC/CDDP联合处理4组,每组7只。腹腔给药10天后,观察裸鼠的体重以及移植瘤的重量和体积变化,western-blot检测移植瘤Mcl-1蛋白表达量。结果:1.PEITC能增加CDDP对胆囊癌细胞、胆管癌细胞、胆囊癌SP细胞的杀伤作用。2.PEITC能够促进CDDP抑制胆囊癌细胞移植瘤的生长,无明显毒副作用。3.PEITC能下调胆囊癌细胞、胆囊癌SP细胞、移植瘤中Mcl-1蛋白,PEITC/CDDP联合治疗组Mcl-1蛋白表达明显低于CDDP单用组。结论:在普通肿瘤细胞系、SP细胞、裸鼠移植瘤三个层面,PEITC均能通过下调Mcl-1蛋白从而增强CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。第三部分髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:阐明胆囊癌细胞中PEITC对Mcl-1谷胱甘肽化修饰的影响和谷胱甘肽化修饰对Mcl-1稳定性的调控。方法:使用PEITC处理胆囊癌GBC-SD细胞,观察其对细胞内Mcl-1 mRNA、还原型谷胱甘肽（GSH）/氧化性谷胱甘肽（GSSG）比例、GSH水平、Mcl-1蛋白表达量、Mcl-1谷胱甘肽化修饰等的影响。并确定Mcl-1蛋白的谷胱甘肽化修饰位点,突变修饰位点致Mcl-1无谷胱甘肽化修饰后,观察突变是否影响PEITC下调Mcl-1蛋白。结果:1.PEITC通过蛋白酶体途径降解胆囊癌细胞Mcl-1蛋白。2.PEITC通过降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例从而降解Mcl-1蛋白。3.PEITC增加胆囊癌细胞内Mcl-1的谷胱甘肽化修饰。4.半胱氨酸16、286是Mcl-1谷胱甘肽化修饰位点。5.突变谷胱甘肽化修饰位点能减慢PEITC降解Mcl-1蛋白。结论:1.PEITC能降低胆囊癌细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例,进而增加Mcl-1的谷胱甘肽化修饰,减弱蛋白稳定性,促进其被蛋白酶体降解,从而增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。2.此作用受半胱氨酸16、286两个Mcl-1谷胱甘肽化修饰位点的调控。第四部分信号传导与转录激活因子3的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:阐明胆囊癌细胞中STAT3的谷胱甘肽化修饰对Mcl-1蛋白生成的调控及对化疗敏感性的影响。方法:使用丁硫氨酸-亚砜亚胺（L-Buthionine-sulfoximine,BSO）处理胆囊癌GBC-SD细胞,观察其对细胞内GSH/GSSG 比例、GSH水平、Mcl-1、STAT3蛋白表达量、STAT3谷胱甘肽化修饰等的影响。分对照、BSO、CDDP、BSO/CDDP联合处理4组,处理胆囊癌GBC-SD细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术定量细胞凋亡率,试剂盒检测细胞caspase 3活性。结果:1.BSO抑制胆囊癌细胞STAT3激活并下调Mcl-1蛋白表达。2.BSO明显降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例。3.BSO增加STAT3的谷胱甘肽化修饰。4.BSO增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。结论:BSO增加STAT3的谷胱甘肽化修饰,抑制其激活从而抑制下游Mcl-1蛋白生成,增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。总之,本实验揭示了抗凋亡蛋白Mcl-1是胆囊癌细胞对CDDP耐药、胆囊癌SP细胞更耐药的新原因;发现了谷胱甘肽化修饰调控Mcl-1蛋白稳定性的新机制:Mcl-1谷胱甘肽化修饰的增加会减弱蛋白稳定性,促其被蛋白酶体降解;首次证实了半胱氨酸16、286是Mcl-1的谷胱甘肽化修饰位点;PEITC通过调控Mcl-1谷胱甘肽化修饰促其降解,增加CDDP杀伤作用经过了肿瘤细胞系、SP细胞和裸鼠移植瘤模型的验证,安全有效,有较好的临床应用价值。此外,通过增加STAT3谷胱甘肽化修饰从而抑制下游Mcl-1蛋白生成,也能增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。