目的：通过构建双质粒表达系统和单质粒表达系统两种原核表达系统，并通过应用19 mer茎环结构的C-变异体和在目的序列中增加包装位点的数量，探讨构建内含大片段嵌合体RNA的耐核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)病毒样颗粒(Virus-like Particles，VLPs)的可能性。 方法：双质粒系统表达内含长片段嵌合体RNA的耐核糖核酸酶的VLPs:首先设计含Bam HI和Hind III酶切位点的引物，扩增MS2噬菌体的编码成熟酶蛋白和衣壳蛋白的1，700 bp序列，Bam HI和Hind III酶切后，与用同样酶切的表达载体pET-28(b)相连接，得到重组载体pET-MC。应用重叠延伸PCR技术扩增3种病毒的6段嵌合体序列，在设计引物时，使嵌合体两端含有Fse I和Pac I酶切位点，Fse I和Pac I酶切后，与用同样酶切的表达载体pACYCDuet-1相连接，得到重组载体pACYC-3V。将双质粒共转化入表达菌株BL21-DE3，通过诱导进行表达，将表达后的VLPs纯化。应用RT-PCR验证VLPs是否包装了全长的RNA片段。然后进行VLPs的稳定性试验和应用HCV RNA国际标准品定值含有嵌合体RNA的VLPs。 单质粒系统表达耐RNase内含长片段嵌合体RNA的VLPs：扩增MS2噬菌体的编码成熟酶蛋白和衣壳蛋白的1，700 bp序列，并将原来的19 mer的包装位点序列改变为C-变异体，酶切后，与用同样酶切的表达载体pET-28(b)相连接，得到重组载体pET-MS2-C。应用重叠PCR扩增3种病毒的5段嵌合体序列(3V-five，包括3段SARS-CoV基因、一段HCV基因和一段H5N1基因)，并在SABS-CoV3和HCV序列之间插入一个19 mer的变异体包装位点序列，在设计引物时，使嵌合体两端含有Not I酶切位点，与Not I酶切的重组载体pET-MS2-C相连接，构建得到表达载体pET-MS2-3V。同时构建三种对照组表达载体N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C和P-3V-pET-P。通过诱导进行表达。最后分别测定N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-MS2-3V 4种表达产物的260 nm吸光度值(A260)，根据公式lA260=0．125 mg/mL计算4种表达产物的表达效率。 结果：双质粒系统表达内含长片段嵌合体RNA的耐RNase的VLPs:成功构建了两种原核表达载体pET-MC和pACYC-3V。经原核表达后得到含全长为2,248 nt的三种病毒6段嵌合体RNA的VLPs;所包装的RNA具有耐RNase和脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonulcease，DNase)消化的特性以及良好的不同温度条件下的稳定性。VLPs五个浓度(106、105、104、103和102 copies/mL)与国际标准物质的溯源定值结果分别是1.354×107 IU/mL、5.740×105 IU/mL、6.580×104 IU/mL、5.428×103IU/mL和9.613×102 IU/mL。 单质粒系统表达耐RNase内含长片段嵌合体RNA的VLPs：成功构建了4种原核表达载体：pET-MS2-3V、P-3V-pET-P、N-P3V-pET-P和N-P3V-pET-C。pET-MS2-3V和P-3V-pET-P经原核表达后得到含全长为1,891 nt的5段嵌合体RNA的VLPs；N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C其原核表达产物VLPs中仅包装了1,200 nt的目的嵌合体RNA。N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-MS2-3V的表达效率分别为0.23、0.35、0.35和0.51 mg/mL。N-P3V-pET-C比N-P3V-pET-P表达效率高52％，而pET-MS2-3V比P-3V-pET-P表达效率高38％。 结论：我们构建的表达载体及原核表达系统，可作为构建和制备耐RNase的含三种病毒嵌合体序列的VLPs的平台，这种VLPs可以作为对同一个标本进行多个病毒的同时检测时可应用的多靶核酸标准品和质控品，既节省了成本，也简化了操作程序。同时也解决了其它无国际标准品RNA病毒检测的溯源问题。