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目的:肾间质纤维化是各种慢性肾脏病进展至终末期,最终导致肾功能严重不全的共同病理过程,目前临床上缺乏完全阻断肾纤维化进程的有效治疗措施。肾间质纤维化的特征表现为肌成纤维细胞的增殖和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）大量沉积,来源于由上皮-间充质转化或内皮-间充质转化产生的成纤维细胞的持续激活是纤维化进展中的重要生物学事件。最近研究表明,Yes相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）及其下游因子在纤维化中异常活化,促进肌成纤维细胞增多,导致ECM过度沉积。因此,抑制YAP活性将是一种新的阻止肾纤维化发生的治疗策略。有研究表明miRNAs作为重要的转录后调控因子与多种肾脏病所致纤维化的发生相关。本研究通过生物信息学分析发现miR-509-3p在小鼠肾纤维化组织中表达下调,另有研究发现miR-509-3p以YAP作为靶点抑制卵巢癌中ECM的产生,推测miR-509-3p可能在肾纤维化中发挥作用。本研究拟采用肾纤维化动物模型和细胞学实验,通过过表达和抑制miR-509-3p,分析其与YAP及其下游基因在肾间质纤维化形成中作用关系,为改善肾脏纤维化提供新的临床治疗思路。研究方法1.利用GEO数据库分析小鼠纤维化肾脏中差异表达的miRNA,筛选出显著下调的miRNA。2.采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测miR-509-3p在健康人和患有慢性肾脏疾病CKD肾纤维化患者的血清中的表达水平。3.为了研究miR-509-3p在肾纤维化中的作用,建立大剂量叶酸（Folic acid,FA）诱导的小鼠肾纤维化模型。通过组织染色（PAS、Masson）和血清生化分析（肌酐、尿素氮）观察肾脏形态改变和评估肾脏滤过功能,确定肾慢性纤维化模型建立成功,并通过免疫组化法观察水通道蛋白1（Aquaporin1,AQP1）和水通道蛋白2（Aquaporin2,AQP2）的表达。4.采用qPCR法验证miR-509-3p在模型小鼠肾组织和血清中的表达情况。5.利用免疫组化、qPCR和蛋白印迹（Western blotting）法等定位和定量检测YAP在纤维化的小鼠和患者肾组织中的表达。6.构建肾纤维化细胞模型,通过qPCR检测miR-509-3p,qPCR和Western blotting法检测YAP的表达及纤维化指标:纤连蛋白（Fibronectin,Fn）、IV型胶原蛋白（Collagen IV,Col IV）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）。7.细胞模型中过表达和抑制miR-509-3p,检测YAP的表达变化,并检测Fibronectin、Collagen IV、α-SMA的含量,同时应用荧光素酶报告基因法确定miR-509-3p与YAP的结合位点。8.为了验证miR-509-3p通过调节YAP及其下游基因,对小鼠肾纤维化进程的调节作用,构建FA肾纤维化模型过表达miR-509-3p。给予FA肾病小鼠尾静脉注射经过化学合成的双链miRNA（agomir）。采用Western blotting和qPCR及免疫组化染色检测YAP的表达及其对下游靶基因CTGF（结缔组织生长因子,Connective tissue growth factor）和CYR61（富含半胱氨酸蛋白61,Cysteinerich61）的转录调节作用。9.采用组织染色（PAS、Masson、免疫组化法）、qPCR、Western blotting等方法分析过表达miR-509-3p小鼠肾脏病理改变,检测纤维化相关蛋白α-SMA、Collagen IV和Fibronectin,钙粘蛋白（E-Cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达变化,同时血清生化检测评估肾功能。结果1.根据GEO数据库筛选差异基因,显示miR-509-3p在小鼠肾纤维化组织中显著下调。在肾纤维化患者血清标本中miR-509-3p表达降低,其表达量与患者肾小球滤过率,肌酐密切相关。2.小鼠FA肾病造模后14天,肾体积缩小,肾组织变薄,肾小管萎缩,肾间质大量炎性细胞浸润和胶原纤维增多;血清肌酐、尿素氮明显上调;AQP1和AQP2在损伤严重区域肾小管表达降低。3.MiR-509-3p在FA肾病小鼠肾组织和血清中低表达。同时,YAP在FA小鼠肾组织中表达上调,且YAP细胞核阳性细胞数增加。在人纤维化肾组织中YAP细胞核阳性细胞数也明显增加。4.在肾纤维化细胞模型中,miR-509-3p低表达且与YAP呈负相关。过表达miR-509-3p可以下调YAP表达水平,抑制纤维化相关蛋白α-SMA、Fibronectin、Collagen IV等的表达。5.荧光素酶报告基因显示miR-509-3p结合于YAP基因的3’-UTR区域。6.FA小鼠过表达miR-509-3p后,YAP及其下游因子CTGF、CYR61表达降低;病理学PAS、Masson染色观察到各组小鼠肾小管损伤减轻,肾间质胶原纤维减少;同时血清生化检测肾功能有所恢复;纤维化相关蛋白α-SMA,Collagen IV,Fibronectin的表达减少。E-Cadherin蛋白表达水平升高,Vimentin蛋白表达水平降低。结论:Mi R-509-3p在人和小鼠肾纤维化组织中显著低表达且与YAP呈负相关,过表达miR-509-3p抑制YAP表达的同时改善叶酸肾病模型的肾间质纤维化和肾功能,提示miR-509-3p通过调节YAP减缓肾纤维化进程,从而保护肾功能。