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目的:头颈部鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤。区域性淋巴结转移的特性是导致头颈鳞癌患者预后不良的主要原因之一。详细的阐明头颈鳞癌细胞侵袭转移分子机制、寻找临床干预因子,对于头颈鳞癌的临床靶向治疗来说具有十分重要的意义。趋化因子受体7（CCR7）是G-蛋白偶联受体家族的一员,其可通过与CCL19及CCL21两个配体相结合,调控头颈鳞癌的增殖、侵袭及迁移的过程。在对头颈鳞癌淋巴结转移机制研究过程中,证实了CCR7能够通过调控下游PI3K/Akt/m TOR、Cdc42、Rac、p70s6k、MAPK家族、pyk2及STAT3等分子的表达参与对头颈鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的调控作用。环状RNA（circRNA）是一类没有5’端帽和3’端poly A尾的闭合环状结构的非编码RNA。大量研究表明circRNA可以作为miRNA“海绵”通过吸附miRNA参与调控肿瘤的生物学功能。此外,circRNA还可以结合RNA结合蛋白,作为蛋白支架以及编码多肽等功能,参与肿瘤的发生发展过程。MicroRNA是一类长度在19-25个核苷酸之间的内源性非编码RNA,他们通过识别特定的mRNA 3’-UTR序列并与之结合,在转录后水平促进其降解或抑制其表达而发挥生物调控作用。Let-7b-5p是let-7家族的一员,在肿瘤的研究中发现let-7b-5p可参与肿瘤细胞周期的调控,抑制肺癌、乳腺癌及卵巢癌等肿瘤的发展进程。MiR-320a-3p是miR-320家族的一员,研究表明miR-320a-3p可能通过抑制HIF1PTEN的α甲基化来抑制非小细胞肺癌的放射抗性。此外,miR-320a-3p还可抑制宫颈癌、结肠癌、肝癌等肿瘤的增殖及转移,抑制肿瘤的发展过程。在本研究中我们主要研究了hsa＿circ＿0000839、let-7b-5p和miR-320a-3p对头颈鳞癌生物学功能的调控作用,let-7b-5p和miR-320a-3p对CCR7的调控作用,以及hsa＿circ＿0000839对miR-320a-3p分子的调控作用,为头颈鳞癌的诊断和治疗提供新的靶点和方向。研究方法:1.Let-7b-5p和miR-320a-3p在头颈鳞癌组织和细胞中的表达水平通过Real-time PCR技术检测let-7b-5p在头颈鳞癌细胞系PCI-37A和PCI-37B中的表达水平,以及miR-320a-3p在头颈鳞癌细胞系Scc9、Scc15及人正常角化上皮细胞Hok中的表达水平。通过收集头颈鳞癌患者标本和下载及分析TCGA数据库中头颈鳞癌患者基因表达数据比较let-7b-5p和miR-320a-3p在头颈鳞癌患者癌组织、癌旁组织及转移淋巴结中的表达水平。2.Hsa＿circ＿0000839在头颈鳞癌组织和细胞中的表达水平通过对5对头颈鳞癌患者癌组织及癌旁组织基因芯片检测,筛选出癌组织中高表达的circRNA,并通过Real-time PCR检测hsa＿circ＿0000839在头颈鳞癌和癌旁组织中的表达量,以及在Scc9、Scc15及Hok细胞中的表达水平。3.Let-7b-5p和miR-320a-3p对头颈鳞癌细胞生物学功能的影响通过细胞转染技术向头颈鳞癌细胞PCI-37A、PCI-37B、Scc9及Scc15中分别转染miRNA mimics,inhibitor以及阴性对照（NC）调节细胞中let-7b-5p及miR-320a-3p的表达水平。应用CCK8细胞增殖实验、细胞划痕愈合实验及transwell侵袭迁移实验检测各转染组细胞增殖、侵袭及迁移能力的改变。4.Let-7b-5p和miR-320a-3p对CCR7表达调控作用分析在头颈鳞癌细胞PCI-37A、PCI-37B、Scc9及Scc15中,通过转染miRNA mimics/inhibitor上调或下调let-7b-5p及miR-320a-3p在细胞中表达量,应用Real-time PCR实验及Western blot实验检测各转染组细胞中CCR7基因和蛋白质表达水平改变。5.Let-7b-5p和miR-320a-3p与CCR7的靶向结合验证应用生物信息学网站及软件预测分析let-7b-5p和miR-320a-3p与CCR7是否存在靶向关系,并通过双荧光素酶报告基因进一步验证let-7b-5p与CCR7 3’-UTR序列存是否在结合位点。6.Let-7b-5p对CCR7调控作用的体内实验验证通过慢病毒感染头颈鳞癌细胞PCI-37B,筛选稳定过表达let-7b-5p的头颈鳞癌细胞株,将肿瘤细胞悬液皮下接种于BALB/c-nu裸鼠进行肿瘤异种移植模型构建,观察各组裸鼠瘤组织生长速度,每3天记录肿瘤的大小。实验分为let-7b-5p过表达组、NC对照组及空白对照组,接种21天后处死各组裸鼠获取成瘤组织比较体积和质量,通过Real-time PCR及Western blot技术检测检测各组瘤体组织中let-7b-5p及CCR7的mRNA和蛋白表达量改变。7.Hsa＿circ＿0000839对头颈鳞癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响构建hsa＿circ＿0000839 siRNA干扰片段,验证干扰效率后,在头颈鳞癌细胞系Scc9及Scc15中进行转染,调节细胞中hsa＿circ＿0000839的表达水平。实验分为si-circ＿0000839转染组、si-NC转染组以及空白对照组。应用CCK8细胞增殖实验、细胞划痕愈合实验及transwell侵袭迁移实验分别检测各转染组细胞增殖、侵袭及迁移能力的改变。8.Hsa＿circ＿0000839对miR-320a-3p和CCR7的表达水平调控通过转染siRNA下调头颈鳞癌细胞Scc9及Scc15中hsa＿circ＿0000839表达水平,应用Real-time PCR实验检测转染后各组细胞中miR-320a-3p和CCR7 mRNA表达水平,变化,Western blot技术检测各转染组中CCR7蛋白表达水平。9.Hsa＿circ＿0000839与miR-320a-3p和let-7b-5p的靶向结合验证通过生物信息学预测分析let-7b-5p和miR-320a-3p与hsa＿circ＿0000839存在靶向关系,通过双荧光素酶报告基因验证hsa＿circ＿0000839与miR-320a-3p序列存在结合位点,通过FISH原位杂交实验验证hsa＿circ＿0000839与miR-320a-3p在细胞内表达共定位。结果:1.Let-7b-5p和miR-320a-3p在头颈鳞癌组织和细胞系中的表达水平对TCGA数据库数据分析结果显示CCR7在头颈鳞癌原发灶中表达水平高于正常组织,并且在肿瘤不同分期,不同阶段表达量均高于正常组织。Real-time PCR检测结果表明let-7b-5p和miR-320a-3p在头颈鳞癌组织中表达量低于癌旁组织。Let-7b-5p在PCI-37A细胞中表达水平高于PCI-37B,miR-320a-3p在Scc9和Scc15中的表达水平低于人正常角化上皮细胞Hok。2.Hsa＿circ＿0000839在头颈鳞癌组织和细胞中的表达水平通过对5对头颈鳞癌及癌旁组织基因芯片分析,结果表明hsa＿circ＿0000839在癌组织中表达水平高于癌旁组织,在组织样本中Real-time PCR检测结果同样验证此结果,在Scc9和Scc15细胞中hsa＿circ＿0000839表达水平明显高于Hok细胞。3.Let-7b-5p和miR-320a-3p对头颈鳞癌细胞增殖、侵袭及迁移能力影响向头颈鳞癌细胞中分别转染let-7b-5p或miR-320a-3p mimics及inhibitor后,细胞中let-7b-5p和miR-320a-3p的表达出现相应的上调及下调。CCK-8实验结果表明,上调let-7b-5p和miR-320a-3p表达后细胞增殖能力下降,而下调let-7b-5p和miR-320a-3p表达后细胞增殖能力上升。Transwell迁移实验及划痕愈合实验结果表明let-7b-5p和miR-320a-3p过表达后,头颈鳞癌细胞迁移能力显著降低,let-7b-5p和miR-320a-3p表达降低后,细胞迁移能力提高。Transwell侵袭实验结果表明let-7b-5p和miR-320a-3p表达升高后,细胞侵袭能力显著下降,而降低let-7b-5p和miR-320a-3p表达水平后,细胞侵袭能力明显提高。4.Let-7b-5p和miR-320a-3p负向调控CCR7表达在头颈鳞癌细胞中过表达let-7b-5p和miR-320a-3p后,CCR7 mRNA及蛋白表达水平明显降低,低表达let-7b-5p和miR-320a-3p后,CCR7 mRNA及蛋白表达水平均提高。5.Let-7b-5p和miR-320a-3p与CCR7的靶向结合验证生物信息学预测分析结果表明let-7b-5p和miR-320a-3p与CCR7存在作用位点,双荧光素酶报告基因验证let-7b-5p与CCR7 mRNA 3’-UTR序列存在结合位点。6.Let-7b-5p对CCR7调控作用的体内实验验证构建let-7b-5p过表达载体,慢病毒感染头颈鳞癌细胞PCI-37B。筛选稳定过表达let-7b-5p细胞株构建肿瘤异种移植模型,实验分为let-7b-5p过表达组、NC对照组及空白对照组。结果表明let-7b-5p过表达组裸鼠肿瘤生长速度明显减慢,成瘤体积和质量均明显减小与对照组。与对照组相比,在let-7b-5p过表达组成瘤组织中,let-7b-5p表达水平明显升高,CCR7 mRNA及蛋白表达水平明显降低。7.Hsa＿circ＿0000839对头颈鳞癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响向头颈鳞癌细胞中转染si-circ＿0000839后,细胞中hsa＿circ＿0000839的表达降低。CCK-8实验结果表明,降低hsa＿circ＿0000839表达后细胞增殖能力下降,Transwell迁移实验及划痕愈合实验结果表明hsa＿circ＿0000839表达降低后,头颈鳞癌细胞迁移能力显著降低,Transwell侵袭实验结果表明hsa＿circ＿0000839表达降低后,细胞侵袭能力显著下降。8.Hsa＿circ＿0000839对miR-320a-3p和CCR7的表达水平调控在头颈鳞癌细胞中降低hsa＿circ＿0000839表达水平后,CCR7 mRNA及蛋白表达水平明显降低,miR-320a-3p表达水平提高。9.Hsa＿circ＿0000839与miR-320a-3p和let-7b-5p的靶向结合验证生物信息学预测分析结果表明hsa＿circ＿0000839和miR-320a-3p及let-7b-5p存在作用位点,双荧光素酶报告基因验证miR-320a-3p与hsa＿circ＿0000839结合位点,FISH原位杂交结果表明miR-320a-3p与hsa＿circ＿0000839表达共定位。结论:MiR-320a-3p及let-7b-5p能够抑制头颈鳞癌细胞增殖、侵袭及迁移过程,并且与CCR7存在负向调控关系。Hsa＿circ＿0000839能够促进头颈鳞癌细胞增殖、侵袭及迁移过程,并且可能作为miR-320a-3p的“海绵”从而调控其对CCR7的表达和功能。