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目的:非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常见的恶性肿瘤之一,也是与癌症相关死亡的最主要原因。尽管多年来在外科手术、放化疗及靶向治疗方面都取得了巨大的进步,但肺癌的5年生存率仍低于15%。其中最主要的原因是大部分患者在初诊时已为晚期肺癌或出现转移。进一步寻找预测肺癌发展的标记物、探讨肺癌发展的分子机制对指导临床诊疗具有重要的临床意义。抑制素βA（InhibinβA,INHBA）是激活素A（activin A）的二硫键连接同源二聚体,也是转化生长因子（TGF）-β（Transforming growth factor（TGF）-β,TGF-β）超家族的成员。多个研究证实INHBA具有促癌和抑癌两种截然相反的生物学作用,也有个别研究提示INHBA与肺癌预后不良相关,但潜在的分子机制仍不清楚。Hippo信号通路是近年来发现的高度保守的信号通路,它能够通过其核心转录调控因子Yes-associated protein（YAP）参与调控体内器官大小以及细胞增殖、凋亡等多个病理生理过程。我们课题组研究也证实Hippo通路参与了肺癌的发生及发展,其中YAP细胞核内表达的增加与肺癌预后不良相关。我们也关注到越来越多研究显示TGF-β和Hippo通路具有关联性。作为TGF-β超家族一员,深入研究INHBA调控Hippo通路的作用和分子机制,将有助于解析NSCLC中TGF-β和Hippo两大信号通路的调控网络。因此,我们拟通过检测INHBA在NSCLC中的表达,并结合体外功能及分子实验探讨INHBA在NSCLC中的生物学功能及潜在的分子机制,为我们理解NSCLC进展的机制和靶向干预提供重要线索。研究方法:（1）在人NSCLC组织标本研究方面,我们收集XXXX医院238例癌及癌旁、30对原发灶与淋巴结转移灶石蜡标本及10对癌与癌旁新鲜标本,采用免疫组织化学（Immunochemistry,IHC）、Western blot或Real-time PCR检测INHBA的表达,以比较癌与癌旁或转移灶组织中INHBA的表达差异,并进一步分析其与临床病理因子、淋巴结转移及预后等的相关性;（2）在研究INHBA对NSCLC生物学功能影响方面,我们首先采用Western blot检测INHBA在NSCLC细胞系及正常支气管上皮HBE细胞中的表达,并分别筛选INHBA相对高表达与低表达细胞系作进一步体外研究;在INHBA高表达细胞系利用si RNA敲降其表达、低表达细胞系转染过表达质粒上调其表达后,采用Western blot检测上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白、Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力,以评估INHBA对肺癌细胞的生物学功能的影响;（3）在研究INHBA是否通过Hippo通路发挥生物学功能方面,我们首先通过双向调控INHBA表达,利用Western blot或Real-time PCR检测Hippo通路关键因子YAP、LATS1/2与二者磷酸化蛋白p YAP、p LATS1/2、下游转录因子CTGF与CYR61的表达,以评估INHBA对Hippo通路的影响;IHC检测238例NSCLC石蜡标本中INHBA的表达是否与YAP蛋白的亚细胞定位具有相关性;核浆分离实验后Western blot分别检测YAP在细胞浆及细胞核内的表达变化,进一步明确INHBA是否影响其亚细胞定位;采用Hippo通路抑制剂维替泊芬（Verteporfin,VP）在过表达INHBA细胞系进行Rescue实验,Western blot检测EMT相关蛋白、Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力,以明确INHBA是否通过Hippo通路发挥生物学功能;（4）在研究INHBA调控Hippo通路的潜在分子机制方面,我们首先通过双向调控INHBA表达,Western blot检测Hippo上游调控蛋白FRMD6、Merlin和WWC1的表达变化,以寻找受INHBA调控的上游因子Merlin;过表达INHBA情况下共转Merlin外源性过表达质粒进行Rescue实验,以明确INHBA是否通过Merlin调节Hippoy通路活性;免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）验证INHBA是否与Merlin蛋白结合。结果:（1）在INHBA的临床意义研究中,我们发现238例NSCLC的INHBA蛋白表达较正常肺泡上皮表达明显升高（P<0.001）;24例配对的新鲜NSCLC组织中的INHBA蛋白及m RNA水平均显著高于癌旁组织（P值均<0.001）;30对淋巴结转移癌中INHBA的蛋白水平较原发灶显著增加（P=0.0015）;统计分析显示238例NSCLC组织中INHBA阳性表达与肿瘤分期晚（TNM II-IV期;P=0.017）和分化差（P=0.016）显著相关;Kaplan–Meier生存曲线显示NSCLC中的INHBA阳性与较短的总体生存时间（overall survival,OS）及无病生存期（disease-free survival,DFS）均显著相关（P值分别为0.002和0.001）;多因素Cox回归分析显示INHBA是NSCLC的独立预后指标（P=0.019）。这些结果表明INHBA与NSCLC预后不良相关,是NSCLC潜在的预测预后标志物。（2）在INHBA对NSCLC细胞的生物学功能研究中,我们在INHBA相对低表达的H1299细胞中过表达INHBA、在相对高表达的A549细胞敲降INHBA表达,发现过表达INHBA后抑制了E-cadherin的表达,并上调了N-cadherin、vimentin和snail的表达,而敲降INHBA后则上调了E-cadherin蛋白表达,并下调N-cadherin、vimentin和snail的表达;Transwell迁移及侵袭实验结果发现过表达INHBA增强了H1299细胞的迁移和侵袭能力,而敲降INHBA后则降低了A549细胞的迁移和侵袭能力。这些结果表明INHBA具有促进NSCLC侵袭的作用。（3）在INHBA是否通过Hippo通路促进NSCLC侵袭研究中,我们发现238例NSCLC石蜡标本的INHBA与细胞浆内YAP阳性表达呈负相关,与YAP细胞核内阳性表达呈正相关（P值分别为0.014和0.045）;过表达INHBA后p-YAP、p-LATS1/2的蛋白水平均显著降低,而敲降INHBA表达后二者均显著升高;此外,过表达INHBA上调了Hippo通路下游转录因子CTGF和CYR61蛋白及m RNA水平,而敲降INHBA则下调了二者的表达水平;核浆分离实验结果显示过表达INHBA后YAP在细胞核内的表达水平显著升高,而在细胞浆中的表达明显下降;我们进一步通过Rescue实验发现Hippo通路抑制剂VP能不同程度逆转INHBA促进NSCLC侵袭的作用。这些结果表明INHBA通过抑制Hippo通路增强NSCLC的侵袭能力。（4）在INHBA通过Merlin调控Hippo通路潜在分子机制研究中,我们发现过表达INHBA后Hippo通路上游调节蛋白FRMD6、Merlin和WWC1中只有Merlin蛋白水平下降,敲降INHBA后也只有Merlin蛋白水平上调;Rescue实验发现过表达Merlin显著逆转了INHBA抑制YAP磷酸化的作用;更有意思的是INHBA对Merlin的m RNA水平无影响,且Co-IP结果发现INHBA可以与Merlin蛋白结合。这些结果表明INHBA在蛋白水平下调Merlin表达抑制Hippo通路活性。结论:（1）我们证实了INHBA在NSCLC中表达上调,与NSCLC预后不良相关,是NSCLC的独立预后因子;（2）我们揭示了INHBA通过在蛋白水平下调Merlin表达从而抑制Hippo通路,并促进YAP细胞核内聚集后激活下游转录因子CTGF与CYR61,进而促进NSCLC的侵袭。