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有毒中药的质量控制是中药控制的难点和重点之一。寻找和发现有毒药物的活性成分和毒性成分(即效应物质)并对其进行质量控制是毒性药物控制的有效手段。甘遂作为中国药典收载的有毒药物,其安全性长期难以控制。传统为降低甘遂毒性使用了多种炮制方法,其中醋炙法、甘草制法和豆腐制法依然为现代所使用。然而至今甘遂的毒性仍无法有效控制,致其临床使用率极低。因此对甘遂的深入研究将可能揭示甘遂的毒效和药效物质基础,从而更好地进行质量控制和临床使用;也将为同属药材的质量控制和使用提供借鉴意义。 中药毒性药物炮制后毒性降低,而活性保留,则其物质基础必然有相应的变化,即炮制后毒性成分降低或转化;而炮制前后相对稳定的共有成分,则与活性成分相关性高。基于此认识,本课题提出以中药炮制为基础的整体轮廓定性、定量分析思路:以色谱轮廓为纽带,建立化学成分、定性方法、定量方法、毒性数据与色谱轮廓的相互关系,用以分析甘遂的效应物质基础。 本课题在分离纯化32个甘遂化学成分基础上,对主要化合物进行了细胞毒活性研究。然后采用质谱检测手段对甘遂化学成分结构类型和分子量分布特点与色谱轮廓关系进行了研究,明确了不同类别和结构特点化合物的色谱分布规律(谱构关系);继而采用直观分析方法和引入质谱-化学计量学方法,系统分析了甘遂生品和三种不同炮制饮片50批样品的整体轮廓图差异,结合急性毒性结果,确认了炮制后降低的成分在色谱中的分布和结构特点;最后对炮制前后共有的13个成分采用程序波长/一测多评方法进行了定量分析研究,测定了75批甘遂及其炮制品中kansuininB,kansuininD,kansuininA,kansuiphorinD,3-O-(2′E,4′Z-decadienoyl)ingenol,3-O-(2′E,4′E-decadienoyl)ingenol,3-O-(2′E,4′Z-decadienoyl)-20-O-acetyl-ingenol,3-O-(2′E,4′E-decadienoyl)一20-O-acetylingenol,3-O-(2′E,4′Z-decadienoyl)-20-deoxyingenol,3-O-(2,3-dimethylbutanoyl)-13-O-dodecanoylingenol,tirucallol,euphol和kansuiphorinA的含量。 本课题在甘遂化学成分谱构关系研究中,首先分析了其主要化合物在大气压化学电离源(APCI)和电喷雾离子源(ESI)下的质谱数据。进而采用母离子扫描检测手段,成功分析了巨大戟二萜不同母核和取代基类型的色谱分布规律。此外还对甘遂药材的MRM测定条件进行了优化。 在不同炮制品炮制前后整体轮廓差异分析中,首先采用同一批生甘遂的不同炮制品进行不同检测器色谱轮廓的直观比较。进而引入质谱-化学计量学方法,采用两种不同原理的质谱数据处理软件(Metalign和XCMS)进行了三种炮制品50批样品的不同炮制品炮制前后共同变化分析,得到了一致的分析结果。实验结果表明采用三种不同方法炮制后,主要降低的是集中在色谱轮廓3-12min,且分子量在400以下的成分;而与毒性相关较大的是12-16min分子量550-600的共有降低成分;进一步结合谱构关系确认该区域是以2,3-二甲基丁酰基为主要取代基的、具有五个氧的巨大戟二萜主要分布区域,且该类成分的紫外吸收均较弱。急性毒性谱效实验结果也证实甘遂色谱图上12-16min的相应提取物是两个有毒性的部位之一。此外本文还对京大戟、狼毒和千金子进行了简单的轮廓直观比较。 在炮制前后共有成分定量方法研究中,选择炮制前后13个主要共有成分进行定量分析(3个假白榄酮二萜,8个巨大戟二萜和2个三萜)。采用常规高效液相色谱-紫外检测器-核壳辛烷键合色谱柱,建立了分析时间为25min的快速高效分析方法。并针对甘遂13个成分特点,首次提出了“外部对照品-程序波长一测多评”的方法进行多成分的质量控制。实验同时采用PB实验设计探讨了方法的耐用性,并成功测定了75批生品及其不同炮制品。 本文通过对甘遂化学成分整体轮廓定性和定量系统研究,为深入研究有毒中药甘遂毒效和药效物质基础奠定了坚实的基础。