丹参中丹酚酸A的转化分离及其对HepG2细胞的抑制作用研究

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丹酚酸A(Sal A)具有多种药理活性,但在丹参药材中含量极低,直接提取纯化难以获得大量高纯度的Sal A,限制了其进一步应用。本论文根据丹酚酸B(Sal B)受热可部分降解为Sal A的特点,建立了丹参药材中Sal B转化为Sal A的方法。研究了丹参素(DSS)和原儿茶醛(Pro A)对Sal A降解速率的影响,并使用大孔吸附树脂与高速逆流色谱(HSCCC)分离制备得到高纯度的DSS、Pro A与Sal A,最后还评价了Sal A与Sal B对于肝癌HepG2细胞的抑制作用。主要研究工作分为四部分:  首先采用热降解方法对Sal A进行转化,研究了加热温度、溶剂种类、加热时间、溶剂pH、液料比、离子强度等因素对Sal B转化为Sal A的影响,获得了丹参药材中Sal B转化为Sal A的最佳条件:以磷酸缓冲液(pH6.0)为提取溶剂,液料比为12∶1,在140℃下加热4h,Sal A的摩尔转化率可以达到53.7%。研究了DSS与Pro A对Sal A稳定性的影响,结果表明DSS不影响Sal A的降解速率,而Pro A能显著抑制Sal A的降解。  其次筛选了大孔吸附树脂,并考察了上样液pH、上样流速、洗脱流速等条件,建立酚酸类成分的分离方法:HZ-816型树脂,径高比1∶1.5,转化液pH经HC1调节为2.0,以2BV/h流速上样,吸附完成后,依次用5BV的水、20%和50%乙醇以4BV/h流速洗脱。馏分经冷冻干燥,水洗脱部分中DSS含量为1.1%,50%乙醇洗脱部分中Pro A与Sal A含量分别为2.2%与14.0%。  然后建立了DSS、Pro A与Sal A的HSCCC分离方法。树脂水洗脱部分所用溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水/乙酸(1∶12∶1.5∶6∶1.5,v/v/v/v/v),分离得到DSS的纯度为96.6%,回收率为70.7%。树脂50%醇洗脱部分采用pH区带逆流色谱(pH-ZRCCC),以石油醚/乙酸乙酯/正丁醇/水(3∶3∶1∶9,v/v/v/v)作为溶剂系统,上相与下相中分别加入10mM三氟乙酸和10mM氨水,分离得到Sal A与Pro A的纯度分别为97.8%、96.5%,回收率分别为58.7%与90.7%。  最后在细胞水平上研究了Sal A与Sal B对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果表明Sal A对HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的抑制率显著强于Sal B,其抑制率与剂量成正比;显示出Sal A可以通过抑制肿瘤细胞增殖和抗肿瘤细胞侵袭迁移的方式来发挥抗肿瘤作用。
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