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雄黄是一味传统的中药,早在两千多年前我国第一部药物学专著《神农本草经》上就有记载。中医认为雄黄性温味辛有毒。归心、肝、胃经,具有解毒杀虫、燥湿祛痰、化瘀等功效,外用可用于痈疽肿毒、疥痫、恶疮、湿疮,蛇虫咬伤等症。最近研究发现,雄黄在抗肿瘤领域具有良好的前景,特别在对肝癌、食管癌、宫颈癌等原发性或转移性肿瘤等恶性血液系统疾病以及的治疗过程中显示出了比较明显的治疗效果。但是由于雄黄不溶于溶剂中,临床应用使用量较大,毒副作用明显,在临床上的应用一直受限。古代人们也认识到了雄黄临床应用中的毒副作用,因此规定雄黄在使用时必须经过炮制步骤,而炮制方法多为水飞法或者干研法。在近代,有研究显示雄黄的纳米化被证明可在一定程度上提高雄黄的溶解性和生物利用度,但过程往往导致过高的氧化砷含量和毒副作用。本课题主要采用传统的水飞工艺与纳米技术相结合,研究不同方法处理的雄黄的抗肿瘤效应,期望降低雄黄的毒副作用并能提高雄黄的生物利用度,使雄黄的临床应用更加安全,高效。 目的:通过肿瘤细胞模型的筛选,选择实验研究所用肿瘤细胞株,并研究不同方法处理的雄黄对所选肿瘤细胞株的抑制增殖作用,并从体内体外两个方面进行研究。 方法: 1.不同粒径的雄黄制备。具体方法有纳米制备工艺、水飞炮制法以及纳米制备工艺与水飞炮制结合法,从而制备不同粒径的雄黄粉体。 2.肿瘤细胞株模型的筛选。采用MTT法,所选肿瘤细胞株包括人黑色素瘤A375细胞株、肺癌细胞株A549、白血病细胞株HL-60、人胰腺癌细胞株panc02、白血病jurkat细胞株。 3.不同粒径的雄黄对人黑色素瘤细胞株的体外抑制增殖作用研究。方法采用流式细胞分析法,进一步分析不同粒径的雄黄对人黑色素瘤细胞株的抑制增殖作用,并观察对细胞周期的影响。 4.纳米水飞雄黄对人黑色素瘤细胞株的体内抑制增殖作用研究。方法采用接种人黑色素瘤的裸鼠模型,研究纳米水飞雄黄对A375荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响。 5.纳米水飞雄黄的抗肿瘤机制研究。采用western bolt实验方法,所用抗体为caspasee酶类与stat-3抗体。进一步分析纳米水飞雄黄抑制A375肿瘤细胞株增殖的机制。 结果: 1.成功制备了纳米雄黄及纳米水飞雄黄的粉体。经粒径检测,原料雄黄的平均粒径为2002nm,水飞雄黄为426nm,纳米雄黄为159nm,纳米水飞雄黄为114nm。 2.肿瘤细胞株的筛选实验发现浓度为20mg/l的雄黄对人黑色素瘤A375细胞株、肺癌细胞株A549、人胰腺癌细胞株panc02、白血病jurkat细胞株均有不同程度的抑制增殖作用,抑制率分别为:86.85%、3.217%、27.45%、84.51%。其中对人黑色素瘤细胞株A375的增殖抑制作用最为显著,并且发现雄黄对人黑色素瘤细胞株的抑制增殖作用具有较好的时-量-效依赖关系。 3.不同方法处理的雄黄的抗肿瘤效应的方法筛选,通过MTT法发现,不同方法处理的雄黄(30mg/l)对人黑色素瘤细胞株的抑制率分别为:普通雄黄(59.77%)、纳米雄黄(74.46%)、水飞雄黄(68.68%)、纳米水飞雄黄(80.74%)。纳米水飞雄黄对人黑色素瘤细胞株的抑制增殖作用最为明显。 4.流式细胞分析实验进一步证明了纳米水飞雄黄抑制人黑色素瘤细胞株的增殖作用是通过诱导细胞凋亡,并改变细胞周期。纳米水飞雄黄组与对照组比较发现,G0/G1期的细胞数量明显减少,S期细胞数量增加,因此纳米水飞雄黄能够将细胞阻滞S期,从而达到诱导细胞凋亡的作用。 5.纳米水飞雄黄对人黑色素瘤抑制增殖作用的体内研究表明:纳米水飞雄黄各剂量组(0.3mg/l-30mg/l)对A375荷瘤小鼠的肿瘤增殖有明显的抑制作用,各剂量组的瘤重与阴性对照组比较有显著性差异(p<0.05)。普通雄黄与纳米水飞雄黄对比研究发现,纳米水飞雄黄的抑瘤率明显高于普通雄黄组,证明纳米水飞雄黄的抑瘤作用显著优于普通雄黄,对比有显著性差异。 6.western blot实验研究表明,纳米水飞雄黄能够激活caspase酶的活性,并抑制STAT-3的活性从而诱导细胞凋亡。 结论:本实验采用的纳米水飞雄黄的制备技术稳定有效,成功率高,显示出比普通雄黄更好的抗肿瘤效应。实验研究发现其作用机制可能与诱导细胞凋亡有关,其机制可能通过激活caspase酶的活性,并抑制STAT-3的活性从而诱导细胞凋亡。体内研究也表明纳米水飞雄黄可以延缓裸鼠的肿瘤生长速度,延长裸鼠的生存时间。本研究证明纳米制备技术与水飞法相结合可以在一定程度上增强雄黄的抗肿瘤效果,使雄黄在临床上的使用更加安全,高效。